高效能有关物质方法学验证的七个设计

方法学验证中定量限也是审评重点关注的，方法的定量限需要不小于报告限，并且需要满足准确度和精密度的要求，定量限以信噪比不低于10为评价标准，但是实际验证中真正的信噪比10附近很难保证定量限浓度点的回收率是符合指导原则的要求的，特别是有本底值的杂质的回收率更是需要考量定量限浓度的合理选择，比如有关物质方法学验证中杂质I的定量限水平S/N约10（相当于供试品的0.02%）的峰面积为1000，而供试品中杂质I的本底值为10000，如果回收率定量限浓度样品发生正偏差，那么回收率很容易为120%，那么提高定量限浓度，使其S/N约25（相当于供试品的0.05%），峰面积约增加一倍为2500，此时如果回收率定量限浓度样品发生正偏差，那么回收率约为108%，仍在规定的回收率限度85%-110%的范围内。

所以针对本底值比较大的特定杂质的定量限度拟定尤其需要关注，拟定的定量限浓度的峰面积仅仅为本底值的10%，定量限浓度的回收率是很难符合方法学验证要求的。如果某个杂质的校正因子很大，与主峰的响应值相差悬殊，在提高定量限浓度水平后，定量限为报告限仍然在本底值的10%以下，可以考虑提高供试品浓度，供试品浓度也无法提高的情况下，考虑弱化本底值，即对供试品进行处理后再进行回收率试验。

以API的有关物质方法学验证为例，在方法学验证中需要应用供试品的项目包括重复性，中间精密度，回收率，耐用性等，在验证这些项目之前，先验证供试品的溶液稳定性很关键，为了提高验证效率，一般在验证过程中，样品都是制备之后24小时连续进样分析的，所以供试品如果不稳定，那么以上涉及的验证项目均会出现偏差，一旦供试品溶液不稳定，考虑几种解决方式更换供试品制备溶剂考察稳定性，或者制备条件加上临用新制，或者在进样室控温，但是即使进样室控温之后，仍需要重新考察供试品的溶液稳定性。

以API为例，有关物质拟定的特定杂质可能包括中间体和降解杂质，如果合成路线比较长，那么杂质之间的极性差距比较大，同时检出这些杂质，在方法开发中，梯度洗脱是必要的，供试品的溶剂选择一般考虑对其溶解较好的梯度系统中的两相溶剂的适当比例混合，如果供试品的极性较小，采用有机相比例比较高的溶剂溶解，很容易发生极性较大的杂质出现色谱峰形异常的溶剂效应。杂质的色谱峰对称性很差，线性项目容易验证失败，所以在溶剂的选择中需要兼顾溶解度和组分的溶剂效应，结合设计五，还需要考虑对供试品的稳定性的影响。

以API为例，方法验证中的供试品浓度并非通用的1mg/ml等，是根据各杂质的限度和仪器检测灵敏进行设计的，但是即使在供试品的溶解性很好的前提下，也不能将供试品的浓度设置的过高，因为可能存在进样残留，即便洗针的溶剂对供试品的溶解度最佳，洗针的时间设置的最长，仍然存在进样残留，那么需要考虑供试品的浓度设计是否合理，必要时需要降低供试品浓度，避免在专属性验证结束后，定量限和检测限验证前需要大量时间去处置系统。