残留溶剂方法开发与优化实用手册

残留溶剂

药事纵横

2023/06/12

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依据ICH Q3A指导原则，药物中的杂质可以分为有机杂质、无机杂质和残留溶剂，可见残留溶剂是药物杂质控制的重要组成之一。

根据定义，残留溶剂是指在原料药、赋形剂或制剂工艺中使用或产生的挥发性有机试剂。近年来，残留溶剂的毒性或对环境的危害性越来越引起医药行业的关注，对残留溶剂控制的相关指导原则也越来越完善。起初，1990年美国药典仅列出了6种需要控制的残留溶剂的限度，自1995年起我国药典开始在附录中收载“有机残留量检查”，也只列出了7种有机溶剂，直到1997年ICH Q3C问世，收载69种在药物中应控制的残留溶剂，2005年起我国药典残留溶剂相关通则与ICH Q3C达成一致。从此，残留溶剂分为4类，第一类溶剂是具有致癌性或对环境有严重危害的溶剂，应避免使用；第二类溶剂是可能引起畸变或神经毒性等不可逆毒性、或其他严重但可逆毒性的溶剂，应限制使用；第三类溶剂是药物中以一般量（≤0.5%）存在时认为对人体无害；第四类溶剂是尚无足够安全性数据的溶剂，这类溶剂的控制限度需根据文献或数据库提供的毒理学研究数据来确定。

对于残留溶剂的检测方法，众所周知是采用气相色谱法。那么气相色谱方法开发流程是怎样的，有哪些经验和技巧呢？

一、开发流程

第一步：全面分析待检测药物合成路线（包括起始物料的合成路线）中使用的有机试剂，除直接使用的有机溶剂外还要分析合成过程中可能会生成的有机溶剂，这一步要尽量罗列全面，不要漏掉任何一个试剂。例如下图中有机试剂A至J都是需要控制的残留溶剂。

某原料药合成路线简图

第二步：查阅待测溶剂的沸点、极性和控制限度，大多数常规溶剂的限度可以在中国药典2020年版四部指导原则0861残留溶剂测定法或ICH Q3C残留溶剂指南中查到，如果所使用的试剂在药典或ICH指导原则中没有明确的限度，则需要查阅相关文献或数据库网站，依据毒理试验数据合理制定其控制限度。

第三步：检测器类型选择，通常FID检测器可以适用于大多数溶剂的检测，当待测溶剂含有强电负性时（如二氯甲烷），也可以选择ECD检测器。

第四步：溶样溶剂选择，溶样溶剂应选择纯度高（干扰峰少）、对供试品溶解性好、本身沸点略高于待测溶剂的溶剂，不推荐用水做溶样溶剂，因为水会缩短色谱柱使用寿命。最常用的溶样溶剂包括N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）、N,N-二甲基乙酰胺（DMA）等，在溶样溶剂筛选时很难预测哪个溶剂更适宜，需要逐个进样后依据结果来筛选。

第五步：进样方式选择，气相色谱进样方式包括顶空进样和直接进样，自顶空进样问世以来，因其对色谱柱和检测器污染较少已成为主流，因此我们在方法开发时首选顶空进样。

第六步：色谱柱选择，根据待测溶剂的极性情况，选择合适的色谱柱，这也是方法开发中极其重要的一步，色谱柱填料类型及规格对待测试剂的分离起着关键作用。气相色谱柱的选择有以下四方面内容：

（1）填料类型：气相色谱柱填料可以分为极性、中等极性和弱极性3种。在方法开发之初，当有多种溶剂需要分离时可以首先尝试涵盖范围较广中等极性色谱柱，然后再分别尝试极性和弱极性色谱柱，这样基本就可以实现全覆盖。

（2）柱长：依据范氏方程，柱长与分离度成正比。当待测有机溶剂数量较少，样品基质也没有明显干扰时，可以选择较短的柱长，如30m，这样可以缩短分析时间，提高分析效率。当所需分析的有机溶剂数量多、分离度不佳或者样品基质有很多干扰峰时就需要选择更长的柱长，如60m、75m。例如，在某药物残留溶剂的分析过程中，起初采用30m长色谱柱，无论怎样调整升温程序，溶剂A与B之间分离度总是小于1.5，更换60m色谱柱后，两者分离度大于2.0，满足分离要求。

（3）内径：通常情况下，内径越小，柱效越高，峰型越好看，但同时柱压会相应增高，柱容量会有所降低。0.25mm~0.53mm是常用的色谱柱内径，内径并不适合越细越好，当各种溶剂分离度都较好时可以选择稍大的内径，降低系统压力，当溶剂间分离不佳需要更窄的峰型时选择细内径。

（4）膜厚：膜厚会影响载样量、分离度、保留时间。通常溶质保留与膜厚度成正比，膜厚度增加可以使溶剂得到更高的保留，改善出峰较早组分的分离，但对出峰较晚组分的分离无改善，甚至会损失分离度。此外增加膜厚，可以增加柱容量，当溶剂数量多、响应偏高或进样量较大时尽量选择厚液膜，否则很容易超载，导致峰型变差。

第七步：载气流速选择，载气流速的选择相对容易，可按最佳流速来设置，不同的内径色谱柱对应不同的最佳载气流速范围，见下表：

通常降低流速可以提高分离度但同时会损失柱效，因此流速的调整需要在分离度改善程度和峰展宽造成的灵敏度损失之间寻找平衡。

第八步：升温程序设置，像高效液相中洗脱梯度一样，气相色谱中的升温程序对分离度有重要影响，在方法开发之初可以先设置一个通用简单的升温程序，然后再根据各溶剂的保留情况进行调整。

经过上述的一系列操作，我们就基本建立了一个残留溶剂检测的初始方法。需要注意的是，方法开发并不是按着以上操作步骤一次性就能解决的，往往需要在初始方法的基础上循环往复的优化各种参数，以达到灵敏度、分离度、回收率等各项要求。下面将讨论当分析方法未达到目标要求时需要怎样优化方法？从哪些流程入手来优化。

二、如何优化

第一、分离度不够

分离度是方法开发的硬性指标，溶剂间分离度不低于1.5是不可打折扣的要求。溶剂的保留时间及分离是溶剂沸点、极性、色谱柱填料类型以及升温程序等各种因素的综合作用的结果。当分离度不佳时可以考虑从以下几方面进行优化。

1）更换色谱柱填料类型：填料类型对溶剂的保留有重要影响，更换色谱柱填料类型是改善分离度的最有效的方法，例如在开发过程中如果在HP-5或DB-1701等色谱柱中总是分离度不适宜，可以考虑更换DB-624色谱柱，可能分离度问题迎刃而解。

2）柱长：当在短柱中分离不好，可以更换同种填料的长柱。

3）升温程序调整：调整的方式包括起始柱温和升温速率。需根据各溶剂的保留时间分布进行有针对性的调整，如果第一个溶剂出峰过晚或过早，那么可以先适当提高或降低起始柱温使第一个出峰的溶剂有一个适宜的保留时间，然后在溶剂分布很稀疏的地方可以适当加快升温速率，在溶剂分布很密集、分离度不好的地方，可以适当降低升温速率。

第二、分析灵敏度不够

一般情况下，我们所开发的方法的定量限至少应低于溶剂限度的3~5倍，这样更能确保限度浓度的样品分析的准确性。对于限度较高的溶剂如乙醇、甲醇、乙酸乙酯等，这个要求很容易达到，但当所分析的溶剂限度很低或是响应因子很低时，往往很难达到所需的灵敏度。以苯为例来说，其限度是0.0002%（2ppm），定量限需要达到的浓度应为0.00004%~0.00007%（0.4ppm~0.7ppm）之间，这是一个挑战。这时想要改善灵敏度可以从以下几方面入手：

1）提高供试品的浓度：溶剂的限度是相对于供试品浓度计算的，提高供试品浓度也就相当于提高了溶剂限度的绝对浓度，响应也就相应提高了。

2）调整分流比：一般情况下，为保护色谱柱和检测器免受污染，分流比设置为10:1，也就是只有10%的样品进入色谱柱和检测器，当溶剂限度很低时，可以把分流比设置成5:1或2:1等，使流入色谱柱和检测器的样品比例更高，响应自然也提高了。

3）提高顶空平衡温度：顶空平衡温度越高，达到气液平衡时溶剂的浓度越高，我们在实际的方法开发中，发现当顶空温度由90℃提高到110℃时，苯的峰面积提高了约1.6倍。

4）改为直接进样：如果顶空进样无法满足要求，可以改为直接进样，灵敏度会大大提高，但是直接进样对色谱柱污染严重，应慎重选择。

第三、回收率偏低或偏高

造成回收率不符合要求的原因通常是基质效应，包括基质减弱效应和基质增强效应，造成的结果是回收率偏低和回收率偏高。

（1）回收率偏低

造成回收率低的原因包括供试品对待测溶剂有吸附作用、供试品与待测溶剂发生反应和待测溶剂沸点过低，挥发损失等，相信大家在实际方法开发中遇到最多的基质减弱效应，也就是回收率偏低。

（2）回收率偏高

除了基质减弱效应，还有基质增强效应，结果是回收率偏高，其原因是供试品占据了色谱系统中部分活性位点，减少了色谱系统与待测溶剂的反应，造成待测溶剂响应偏高。

解决基质增强效应的方法包括1）在灵敏度允许的条件下适当降低供试品溶度；2）加入一定量的分析保护剂，保护剂会与色谱系统中的活性位点发生反应，达到保护残留溶剂的作用。例如：某残留溶剂回收率偏高，约为120%，当向溶液中添加一定量醇类保护剂后，待测溶剂的回收率为103%左右，符合要求；3）当以上方法不能解决时，可以采用终极方法，即采用标准加入法测定回收率，这样可以完全消除对照溶液与供试品溶液基质的差别。

要而论之，分析条件优化的目的是采用最简便的操作、在最短的时间内达到符合要求的分离度、灵敏度和准确度。如果在初始条件下难分离对的分离度就符合要求，那么我们可以通过调整升温程序、流速等手段缩短分析时间，否则，我们应设法提高分离度，当然这个过程可能会损失一定的灵敏度和分析时间，我们所要做的是寻找其中的平衡点。

以上是我对于残留溶剂方法开发的一些经验，希望能对大家有帮助。