药物杂质对照品的制备获取方法-富集法！

药物杂质

药事纵横

2023/03/27

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药品杂质对照品是药物质量研究的关键因素，然而有些杂质对照品价格昂贵，例如25mg瓶装的化合物往往需要数万元，这极其加大了企业的研发成本。杂质对照品价格之所以昂贵的原因一方面在于合成和提纯难度大、物料和人工成本等，另一方面在于某杂质为自身工艺所产生，含量低且结构未知，市场上购买不到。笔者有着多年的药物杂质分离纯化工作，本文主要讨论未知结构且含量微小的杂质对照品的制备获取方法-富集法，文末有实例分享，欢迎大家探讨。

药物杂质主要来源于两方面：合成过程和贮藏过程中生成的杂质。对于质量研究中出现的某个杂质，通过合成过程的杂质谱分析，仍无法推导其可能的结构式，且含量微小时，此时只能通过“富集法”。“富集法”需要耗费一定的物料、试剂、人工和时间成本，如何提高富集法的效率，值得思考。

一、富集法的目的和方法

富集法的目的在于运用各种分离方法，从混合物中富集未知结构且含量微小的化合物。因此，富集法第一步在于目标混合物的获取。一般情况下，根据该杂质的来源：合成过程或贮藏过程。对于合成过程中产生的杂质，通常参照工艺路线，改变反应物料比和反应温度、时间等，收集获得的中间体或者滤液进行分离；而对于贮藏过程产生的杂质，则参考稳定性影响因素试验，采用高温、高湿、酸碱、氧化等破坏条件验，从而得到目标混合物。

富集法第二步在于综合运用各种分离方法（结晶、萃取、制备色谱等），富集得到目标化合物。由于本文主要讨论含量微小杂质的富集，从提升工作效率方面考虑，下文主要讨论制备色谱法在富集法的开发应用，包括：反相制备色谱和正相制备色谱。

二、富集法的方法开发过程

2.1分析目标混合物的有关性质

利用液质联用技术，分析混合物中目标化合物的分子量和分离情况，了解该化合物的亲酯亲水性，考察目标杂质峰和附近的色谱峰在不同的流动相（酸碱性或缓冲盐）中的分离度差异。配制目标杂质的混合物溶液，考察在冰浴或室温过夜放置的稳定性，为后期收集的制备溶液的去除提供参考依据。

2. 2 对于目标混合物的预处理

目标混合物预处理的目的是为了去除影响分离纯化的其他杂质峰，从而提高分离效率。例如参照工艺合成过程得到的是反应液时，由于主成分比例高，制备色谱分离时，容易浓度超载，进而形成宽峰和拖尾，降低分离度。因而优选通过析晶法去除主产物或者收集浓缩母液。而对于强制降解试验中的酸碱或氧化法，则通常需要调节Ph至中性或淬灭氧化剂。另外，可以加入有机相萃取反应液，考察目标杂质在有机相和水相的溶解度差异，初步提纯。

2.3制备色谱方法的选择

制备色谱方法包括反相制备色谱和正相制备色谱，反相制备色谱流动相中的水相常加入酸或缓冲盐（例如：甲酸、乙酸铵），有机相则常使用甲醇或乙腈，适用于非极性或弱极性化合物的分离。正相制备色谱流动相都是有机相，可自由选择正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、乙醇等两相或多相混合，适用于极性化合物和异构体的分离。亲水混合物优选反相制备色谱，而亲酯混合物两者皆可使用，有着不同的选择性。需要注意的是，正相制备色谱，不同有机相混合洗脱时，出峰顺序可能会有所不同。

2.4制备色谱方法的开发

2.4.1 初步快速分离富集

由于杂质含量微小且通常成分复杂，一次分离往往难以得到纯度合格的杂质对照品。因而分离纯化的第一步是快速的初步富集，即通过建立反相或正相制备方法，优选等度洗脱，以“浓度超载”或“体积超载”连续进样，收集目标杂质对应的色谱峰段。需要注意的是，对于成分复杂者，此种连续进样法，色谱峰型可能相当难看，我们需要分段收集送检，定位到目标杂质所在位置即可。

对于初步富集得到的制备液体，往往体积比较多，需要浓缩除去有关溶剂。从“2.1分析目标混合物的有关性质”中，我们可以得到目标杂质的稳定性和亲水亲酯性。对于制备溶液，如果是采用正相制备色谱的话，低温减压旋除有机溶剂即可。如果是反相制备色谱的话，由于含有水相，分以下两种情况操作。亲酯性的话则低温减压旋除有机相，加入其它不溶于水的有机相（乙酸乙酯或二氯甲烷）萃取，低温减压旋除有机溶剂。亲水性且杂质稳定的话，则减压旋除大部分水相；亲水性且杂质不稳定的话，可以通过冷冻干燥法浓缩。

2.4.2进一步细分纯化

得到初步的分离富集浓缩液体后，目标杂质的含量比往往提高不少。此时需要进行细分纯化。由于经过初步分离后，主成分已经去除或者大部分去除。制备液相方法的开发可以在初步富集方法的基础上进行调整，加大进样而不受主成分的宽峰和拖尾影响。此过程主要考虑的是目标杂质的分离度，以得到纯度合格的目标杂质。通过调节洗脱梯度，水相调节剂的添加（酸碱、缓冲盐），有机相的选择（单一或复配）正相溶剂的选择（两相或者多相）。值得一提的是，由于正相制备色谱的特殊选择性，对于难以分离的同分异构体或者极性相近者，往往有意想不到的分离度。

2.4.3 纯化分离后处理

纯化分离结束后，去除溶液即可得到目标杂质。对于不同的亲水亲酯性，不同的杂质稳定性，具体操作请参考“2.4.1”制备液体的浓缩去除。需要注意的是，对于反相制备色谱水相加入缓冲盐分离的，需要采用不含盐的水相-有机相再次制备除去缓冲盐。最后就是基于大部分杂质的热不稳定性，整个纯化分离过程，尽可能冰浴低温保存，或者更低温度保存。

实例分享：某抗生素杂质的制备富集过程

目标杂质混合物的获取方法

影响因素试验发现，该杂质在高温高湿下有生成的趋势，然而通过改变温度和湿度，该杂质含量最多约0.5%左右，且结构无法推导出来。

分析目标混合物的有关性质

通过液质联用，得知该化合物分子量M，主成分约95%，目标杂质峰附近有多个杂质峰，成分较复杂。目标杂质偏亲水性，反相洗脱出峰快。该杂质稳定，耐热。

对于目标混合物的预处理

往破坏降解物加入水和乙酸乙酯混合溶液，萃取分液，收集水相。

初步快速分离富集

由于目标杂质亲水性，首选反相制备色谱。参照反相分析方法，调节水相和有机相，建立等度洗脱方法，快速分离富集。

进一步细分纯化

优化反相制备色谱法，梯度洗脱，得到纯度合格的目标杂质制备液。

纯化分离后处理