新进展 | 全球首款DMD基因疗法中生物标志物分析技术

杜氏肌营养不良症基因疗法

药融圈

2022/12/16

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肌营养不良症：在临床表现主要分为杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）和贝克型肌营养不良（Becker Muscular Dystrophy, BMD）。

杜氏肌营养不良症是一种罕见的致命性神经肌肉遗传病，全球新生男孩发病率约1/3500-1/5000，据估计全球每年有约20000名儿童被诊断患病。致病基因主要降低抗肌萎缩蛋白（Dystrophin）表达量或导致蛋白质功能障碍，进而引发一系列肌肉疾病。

DMD临床上缺乏治愈性治疗手段，主要是激素及激素替代疗法等，急需开发新型疗法。目前DMD创新性治疗方法主要策略为恢复抗肌萎缩蛋白表达和功能，已批准和正在开发的有基因治疗、外显子跳跃治疗、基因编辑和终止密码子通读（《关注罕见病！杜氏肌营养不良症药物治疗遇困，基因疗法或是突破点》）。

2022年11月28日，Sarepta Therapeutics宣布其基因疗法SRP-9001生物制品许可申请（BLA）已被美国FDA接受，这是首个可能获批的治疗DMD患者的基因疗法。该疗法采用AAVrh74病毒载体将编码micro-dystrophin（微抗肌萎缩蛋白）基因递送到肌肉组织，使其表达缩短的功能型抗肌萎缩蛋白。目前BLA数据资料主要根据早期三个临床研究结果，获得了临床生物标志物和功能获益数据支持。

本疗法一项临床II期实验采用Western Blot和免疫荧光技术定量检测抗肌萎缩蛋白表达，作为主要和次要疗效指标。目前正在进行全球多中心III期临床研究（EMBARK）次要疗效指标采用Western Blot定量检测12周时微抗肌萎缩蛋白表达。作为DMD治疗中重要的生物标志物，在几种疗法获批时，抗肌萎缩蛋白定量已被使用作为次要终点生物标志物，实现早期和准确预测临床终点受益，加速审批。

目前有多种定量方面来评估抗肌萎缩蛋白表达和分布，有时需要多种方法来正确评估。美国FDA发布最新版肌营养不良症行业指南草案中列出4种主要方法。

4种方法各有优势和局限

免疫荧光技术

免疫荧光技术被许多病理实验室采用检测抗肌萎缩蛋白表达，但仅提供半定量结果。优点是正确定位蛋白质在肌膜相对表达，可评估抗肌萎缩蛋白阳性纤维（PDPF）的百分比和纤维康肌萎缩蛋白强度。

传统蛋白质免疫印迹方法

传统蛋白质免疫印迹方法（Western Blot）是常规蛋白质分子量大小定性和定量标准方法。然而，抗肌萎缩蛋白是一种427kD大分子量蛋白质，并且通常表达丰度很低，给传统WB定量检测带来了很大挑战。而且从WB技术方面，实验步骤太多，方法一致性和可靠性是经常遇到的技术挑战，所以行业趋势是被创新性技术所取代。

毛细管电泳免疫学技术

毛细管电泳免疫学技术（Capillary Western，也称为Digital Western或Simple Western）是非常有前景的新一代抗肌萎缩蛋白定量检测方法，可使用更少样本量，实现更快和更简单的蛋白质表达定量分析。Digital Western将Western Blot技术和ELISA技术合二为一，具备传统WB可视化定性优势，同时具备ELISA免疫学实验精准定量能力，其灵敏度和精密度符合高标准生物分析要求，可利用微量组织样本实现内源性蛋白质精准定量，同时基于本技术设备可实现自动化和标准化实验流程，软件符合监管部门法规要求。

质谱法

质谱法的潜在优势是可靠性、准确性和灵敏度高。对于抗肌萎缩蛋白实验，需要将稳定同位素标记的多肽加入到溶解的人类肌肉样本中。有相关研究利用稳定同位素标记的小鼠肌肉和人类肌肉活检样本混合，开发了一个宽动态范围精准的可靠的抗肌萎缩蛋白定量方法。但质谱方法需要专业技术操作，需要系统培训和相对复杂的样本前处理，系统购置成本偏高。

抗肌萎缩蛋白生物分析方法展望

作为Dystrophin定量分析的新兴技术，质谱方法和全自动毛细管Digital Western技术都受到广泛关注，有潜力作为临床活检样本Dystrophin生物标志物可靠的生物分析方法。特别是全自动毛细管Digital Western技术，目前已经在临床细胞系、动物样本和DMD病人组织样本上经过了广泛使用和验证，有10多个全球领先的DMD临床前和临床项目采用Digital Western技术检测Dystrophin。

案例一

BioMarin公司2018年首先验证了毛细管Digital Western定量检测BMD和DMD病人Dystrophin表达可靠性，可作为DMD临床药物开发生物标志物检测技术。

案例二

AAV6-Cas9/gE51基因编辑猪和人DMD模型系统，Digital Western定量分析骨骼肌成肌细胞和心肌细胞中全长Dystrophin和缩短型Dystrophin表达。

全自动毛细管Digital Western技术加快DMD基因治疗开发

全自动毛细管Digital Western技术作为创新性毛细管电泳免疫学技术，此技术已被基因治疗和核酸药物领域领导者广泛采用，如Ionis Pharmaceuticals、Sarepta、pfizer、Regenxbio、Arcturus、MeiraGTx、Editas medicine、CRISPR Therapeutics、Alnylam、Dicerna、Arrowhead、Moderna、BioNtech、杭州嘉因生物、石药集团等。

针对基因治疗和核酸疗法生物分析优势

Digital Western技术适合基因疗法体外和体内各种模型中靶蛋白表达定量分析，适用于细胞系、类器官模型、小动物模型、非人灵长类动物模型和临床病人样本关键蛋白质生物标志物定量分析；

符合工业对自动化、标准化和效率的追求，3个小时获得一批实验数据，大大提高了实验效率，同时减少人力投入。系统软件符合FDA 21 CFR Part 11合规性需求，满足多中心临床试验对数据一致性和可比性的需求；

Digital Western技术样本量需求是传统技术几十分之一，只需要3μL样本就可实现多重蛋白质表达检测，特别适合微量珍贵样本，如DMD病人活检组织样本；

Digital Western实现大分子量蛋白质精准定量，在基因疗法研发中，从in-vitro到in-vivo, 可建立药物剂量与PD生物标志物关系，实现量效关系和时效关系准确分析，特别是靶蛋白表达水平可作为替代生物标志物时，如抗肌萎缩蛋白。

面对基因治疗行业靶点和适应症的激烈竞争，迫切需要提升药物研发效率，Digital Western技术将在基因疗法领域发挥更重要的作用。

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参考文献：

1. Sarepta Therapeutics Announces That U.S. FDA has Accepted for Filing and Granted Priority Review for the Biologics License Application for SRP-9001, Sarepta’s Gene Therapy for the Treatment of Ambulant Individuals with Duchenne Muscular Dystrophy | Sarepta Therapeutics, Inc.

2. https://www.mda.org/sites/default/files/2020/10/MDA_DMD_Fact_Sheet_Oct_2020.pdf

3. A Randomized, Double-blind, Placebo-controlled Study of SRP-9001 (Delandistrogene Moxeparvovec) for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) - Full Text View - ClinicalTrials.gov

4. A Gene Transfer Therapy Study to Evaluate the Safety and Efficacy of SRP-9001 (Delandistrogene Moxeparvovec) in Participants With Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) - Full Text View - ClinicalTrials.gov

5. Dystrophinopathy Guidance Master_Sept30Final (parentprojectmd.org)

6. Dongsheng Duan., Nathalie Goemans. et al. Duchenne muscular dystrophy. Nature review disease primer (2021)

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