CRISPR-Cas9对新药发现有重大意义，它能使人们更深入地了解疾病过程，并开发出具有突破性的基因药物。随着这些新型细胞和基因疗法应用于临床，仍有待解决一些关键问题。
剑桥大学工程生物学的Alasdair Russell博士提出了该领域最受关注的问题，涉及了CRISPR技术的安全性问题。让我们一起来看看。
01.取得的进展
CRISPR-Cas9是一种非常精确和高效的工具，然而它容易发生罕见的、偏离目标基因的意外编辑。虽然CRISPR会在基因组的非预期位置进行编辑，从而引发安全担忧，但现在有一系列计算工具和分析方法可以评估和量化这类事件。
今年3月，美国FDA发布了关于在基因治疗产品中使用CRISPR的指导草案。建议使用多种正交方法(例如在计算机模拟、生化或基于细胞的分析中)以及在多个患者样本中(如有可能)确定靶上编辑和脱靶编辑。
根据指导草案，领先的CRISPR治疗公司已经发布了应对脱靶的策略，为未来的CRISPR治疗发展提供了清晰的路线图。（《CRD：首个CRISPR疗法获批临床，用于治疗杜氏肌营养不良》）
02 .如何应对目标位点的遗传杂质
CRISPR-Cas9的工作原理是切断外源DNA，沉默外源基因的表达。细胞内的DNA修复是概率性的，因为给定的DNA切口修复的方式有多种。
当应用于一组细胞（例如用于CAR-T治疗的T细胞）或完整组织（例如眼睛中的视网膜组织）时，不同的细胞有不同的编辑，且并非所有细胞都会沉默目标基因。这是一种遗传杂质（称为嵌合体），在所有物种中普遍存在。目前还没有可行的解决方案来解决细胞和基因治疗目标位点的遗传杂质。
大量缺失和基因组重组也会影响目标基因。多个学术小组发现，在长时间暴露于CRISPR-Cas9后，靶点出现了罕见的长段DNA丢失现象。此外，当多个基因同时被锁定为沉默的目标时，基因组中间的片段可能会打乱。
这使Beam Therapeutics公司在FDA持有Beam-201碱基编辑器被暂停。而后，为了应对这个问题，该领域采用了一种更严格的方法来处理任何基因组重组的频率，其方式类似于目前处理脱靶编辑的方式。FDA的指导草案建议用稳健的方法对基因组重组和大规模缺失进行评估。
03.下一代CRISPR CAR-T药物能否靶向实体瘤
绝大多数CRISPR技术治疗公司至少有一个专注于下一代细胞疗法的项目。为了增强这些疗法(持久性、有效性、安全性)，需要在给定的细胞内沉默多个基因。多重沉默是CRISPR在这一领域实现其全部价值的一个重要障碍。
人们认识到，需要3-12个基因修饰来分别增强自体和异体CAR-T治疗。如上所述，CRISPR导致了靶基因的遗传杂质，只有一小部分编辑使基因沉默。重要的是，当扩大要沉默的基因数量时，得到所有所需编辑的细胞的概率将大大降低。
在已经发表的案例中有一个例子，三个基因沉默的下一代CAR-T治疗患者含有不到2%的细胞，所有三个基因都有理想的编辑。多重编辑细胞的低比例给制造带来了巨大挑战，因为研究人员必须大量投资于新方法，以纯化这些罕见的、与治疗相关的细胞。
但也存在一些阻碍，譬如在自体细胞疗法中用于制造CAR-T药物的患者来源的T细胞本身就受到了损害。这是因为T细胞来源于接受了毒性预处理化疗方案的患者。在这种情况下，用多重基因编辑产生下一代CAR-T药物通常被认为是不可行的。
为了解决这个问题，大多数CAR-T计划都专注于使用健康的供体T细胞作为开发现成的CAR-T药物的基础。但由于CAR-T被视为外来基因（移植物与宿主病），通常需要沉默更多的基因（最多8-12个）以克服排斥反应。
这就提出了“多重编辑上限”的概念，在这个上限之上沉默更多的基因(由于遗传杂质)是不可实现的。目前，多重基因上限明显低于同时沉默所需的8-12个基因。如果下一代CAR-T要像预测的那样，帮助市场从12亿美元(2021年)扩大到2031年的220亿美元，就必须克服切割部位DNA杂质导致的这种多倍上限。
04.未来的挑战
在一个完整的患病器官内，不可能应用一种制造工艺以理想的编辑“纯化”细胞。在这个问题解决之前，只有治疗窗口宽的疾病(即小水平的基因校正或沉默)才会被大多数CRISPR技术所触及。
此外，一个不太被重视的问题是，我们身体中绝大多数受遗传疾病影响的细胞都没有进行活跃的细胞分裂。这是一个重要的发现，因为目前所有重写基因的技术(包括碱基编辑器和PRIME编辑器)在没有循环的细胞中都是低效的。如果CRISPR真的要给医学带来革命性的变化，我们作为该领域就必须解决这个问题。
参考资料：www.labiotech.eu
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