方法学验证：定量限浓度的回收率该怎么做

定量限浓度回收率

药事纵横

2021/09/14

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本文标题问题的存在基础是，有的方法学验证设计了4个水平的加标回收试验，比如定量限、50%、100%、150%，对于那些仅设置50%、100%、150%或者80%、100%、120%等浓度水平，不考虑更低浓度水平的验证而言，问题就不复存在了。

那到底这种做法来源于哪儿？有一个但不唯一的来源可能是ICHQ2（R1）中关于定量限验证时的“Recommended Data”：

原文：The limit （quantitationlimit）shouldbe subsequently validated by the analysis of a suitable number of samples knownto be near or prepared at the quantitation limit.

译文：定量限需要分析适当数量的样品去验证，这些样品中的杂质浓度应该接近定量限或按定量限浓度进行制备。

因此，在该问题存在的前提下，本文抛砖引玉，浅谈一些想法。

对于这个问题，不得不先说一下方法学验证中的准确度实验，想必大家应该很熟悉了，中国药典2020年版通则9101给出的定义为，准确度系指用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度，一般用回收率（%）表示。

具体做法想必也无需赘述，但具体实施却有变化，有发展。以中国药典为例，2020年版药典相对于2015年版药典，在具体的描述上有很多不同之处，这些不同之处传递的信号表明方法学验证趋向于更加科学和合理，更加贯彻了为使用目的而验证的核心理念。

比如说，对于准确度实验一般做法的描述，两版药典的描述对比如下：

其实并不是从2020版药典开始，不知从何时起，业内有人开始在做准确度实验时，不再局限于低、中、高三个浓度的考察了，进一步设置了定量限水平的回收率，理由当然也很充分。很多人听说了这个做法，也去做了，只是做的有点痛苦。其中明显的区别是2015版药典对于加标水平的描述，在2020版药典里被一句话给概括了：浓度的设定应考虑样品的浓度范围。如此一来，对于浓度水平的设定就说的非常清楚但不具体，这显得非常指导原则。

具体做法不一而足，就业内存在的一种做法示例如下：

1、先做定量限考察：一般以信噪比为10：1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限。

2、回收率考察：除了常规的低、中、高三个浓度（比如50%、100%、150%），在定量限浓度设置回收率考察。

3、计算12个加标水平回收率的RSD值。

那么我们简单分析一下上述做法为什么会很痛苦：

1、假设这个方法有10个杂质，如果不幸运的话，因为各个杂质响应的差异，按信噪比为10：1考察，可能出现这10个杂质的定量限浓度各不相同。那么加标试验就需按10个杂质各自的定量限浓度配制，不管怎么设计，想想都挺麻烦。

2、在好不容易把溶液设计配制好，进样分析时，还在担心这个水平的回收率是否能通过拟定的验证要求，毕竟浓度低，误差大。

3、在忐忑中迎来了数据处理的时刻，万幸各个杂质的定量限水平回收率都满足拟定的要求，比如说85%~115%（有人比较聪明，把定量限水平回收率限度放宽了）。确实都在85%~115%范围内没错，但可能出现了偏低或偏高的情况，而正常浓度水平的回收率范围设置的是90%~108%，基本处于100%左右，此时合并计算12个水平的RSD出了问题，超标了！又有聪明人说了，定量限水平的回收率我们不参与RSD的计算，是否可行暂且不论，这个不参与计算的逻辑基础在哪儿呢？因为参与后不合格吗？

何必为难自己呢？下面提供一种“包过”的做法，不过仅供参考，抛转引玉：

定量限浓度的回收率该怎么做？这个问题不妨换一种说法：相对于50%的加标水平，为了把方法验证的更加充分，更低浓度的加标回收率该怎么做？更低浓度不等于信噪比为10:1的定量限浓度，也没有这种要求。

话不多说，先上实施例：

1、假设某有关物质方法需要检测8个杂质，样品浓度为1mg/ml，杂质限度为均不得过0.15%。

2、根据药典一般要求以及一般做法，按信噪比10:1考察各个杂质的定量限浓度，假设考察结果如下：

注：1、相对于样品浓度百分比（%）：定量限浓度除以样品浓度（1mg/ml），乘以100%。

2、相对于限度0.15%百分比（%）：将0.15%作为加标100%的水平时，定量限浓度相对应的加标水平。

3、根据定量限考察结果，8个杂质中灵敏度最差的为IMP-5与IMP-8。那么回收率加标水平除了常规的低、中、高三个点设计外，各个杂质更低水平的加标浓度可以统一设置为15%~20%即可。

上述实施例仅作为一种可参考的具体方式，除此之外，可以更加简单粗暴的进行回收率加标水平的设置。比如，在综合考虑了杂质限度要求以及各个杂质的定量限水平后，可直接设置30%、100%、150%，或者30%、80%、120%三个水平的回收率试验。

我们都是爱学习，勤思考的好同志，所以必须要问一句，上述做法的理论基础在哪儿，内在逻辑是什么，有没有法规支持，有没有审评风险？

下面我们就来找一下这方面的信息，给自己一个安慰，也给他人一个交代。

理论基础及法规支持：

1、各国药典以及ICH说，分析方法验证的目的是证明建立的方法适合于相应检测要求。

2、ICH对于回收率的要求：

原文：Accuracyshould be assessed using a minimum of 9 determinations over a minimum of 3concentration levels covering the specified range (e.g., 3 concentrations/3replicates each of the total analytical procedure).

译文：准确度应该采用至少3个浓度（涵盖拟定的范围）9份样品进行评估（比如3个浓度各3份平行样）。

解析：其中关于加标浓度的描述为“coveringthe specified range”，那么我们进一步看一下“specified range”是如何规定的：

原文：forthe determination of an impurity: from the reporting level of an impurity to120% of the specification。

译文：对于杂质检测而言，范围应该包括杂质的报告限（ICHQ3A、ICHQ3B）至限度的120%。

解析：范围下限一般为0.05%（对于大于2g/天的原料药为0.03%，制剂会更高）。

内在逻辑：

1、满足使用需求：控制需求一般是报告限（0.05%）至限度的120%，且并无加标水平的明确设置要求，理论上可以在该范围内任意设置。

2、定量限的要求：一般情况下杂质的定量限不高于ICH要求的报告限即可满足要求（最多我们自己严格要求一下，再设置一个更低点的忽略限）。因此，假设杂质限度为0.15%，报告限为0.05%，那么定量限做到0.01%~0.02%足以满足检测要求，可据此设置合理的样品浓度或者进样体积。

3、对于杂质限度为0.15%的情况，其加标水平在20%或30%时对应的限度是0.03%或0.045%，可见足以满足产品的质量控制需求。可能有人说了，我们样品实际检出杂质都是0.003%的水平。怎么说呢，信不信把你的样品浓度再加大10倍，还可以看到很多之前看不到的杂质！

由于各个杂质的响应差异，在同一样品浓度和进样体积的情况下，可能某些杂质的定量限异常低，此时如果按该浓度做加标回收，可想而知的难度。

审评风险：

审评并不是一刀切，无需过分担心，有理走遍天下，何况是科学的道理。当然我们可以选择简单但更为保守的做法，比如在杂质灵敏度满足要求的情况下，更低加标水平统一设置为10%，相对于100%的限度水平，已是十分之一，应该足以满足质量控制需求了吧。真的无需对各个杂质在各自的定量限浓度进行加标回收试验。

类似的验证同样如此，满足使用目的和要求即可。比如线性与范围，对于限度为0.15%的杂质，范围验证到10%显然是没有必要的，即使线性良好；再比如，对于忽略限为0.02%~0.03%的杂质检测，把定量限做到0.0001%（信噪比为10）显然也是没有必要的，即使方法灵敏度确实能做到这么高。总之，方法需要合理的设计，验证无需过度。

结语：

本文所述可能不具有普适性，仅代表业内一部分人的实验现象，对于有的团队可能压根不存在上述情况。还是那句老话，本文抛砖引玉以供讨论，哪怕对百里有一能够有所启发已是功德圆满。