清洁验证限度计算及方法学验证

方法学

药事纵横

2021/07/23

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药物研发完成小试研究以后，进入预中试或者中试生产阶段，这一阶段通常需要在药厂完成，并遵守GMP关于设备的使用和清洁要求，清洁符合标准的基本原则是证明清洁方法能够去除污染物或将污染降低至可接受的水平。当单品种单独生产线时，只要目视洁净就可以，当多产品共线生产时，则需要考虑上一品种在下一品种中的残留，因为这些残留可能产生副反应或者毒副作用。所以在进行清洁验证前要计算允许残留限度（即检验清洁是否合格的标准），有三个比较常用的计算残留的方法，分别是基于毒理的限度、基于浓度的10ppm的限度和基于最低日治疗剂量的千分之一的限度。

1、基于毒理的限度标准

2、基于浓度的10ppm的限度标准

3、基于最低日治疗剂量的千分之一的限度标准

在计算清洁限度的时候需要注意所讨论产品的日标准治疗剂量（有效成分）和下一产品的日标准治疗剂量（制剂）的区别，例如某制剂规格2ml:200mg，日治疗剂量20mg/kg，成年标准体重50kg，那么日标准治疗剂量（有效成分）为20mg/kg×50kg=1000mg，日标准治疗剂量（制剂）为1000mg÷200mg×2ml=10g。

清洁限度确定以后，进行清洁方法验证，可根据《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》和《中国药典2020年版》9101 分析方法验证指导原则等制定验证内容，验证指标主要包括专属性、检测限、定量限、线性与范围、仪器精密度、重复性、中间精密度、准确度、溶液稳定性和耐用性。

1.溶液配制：

1.1空白溶液：水

1.2空白棉签溶液：取2个棉签放入具塞试管中，精密加入水10ml，密封，超声10分钟，取超声后溶液过滤即得。

1.3对照品溶液：精密称取xxxx对照品xxmg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为擦拭限度对照品溶液。

1.4供试品溶液：精密称取xxxx（含量约为100%）约xxmg，置于100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，在10*10cm的区域均匀涂布0.5ml，待溶剂挥干后，用2个棉签擦拭，每个棉签分别先横向蛇形擦拭，再翻转棉签纵向蛇形擦拭，之后将2根擦拭棉签放入具塞试管中，精密加入水10ml，密封，超声10分钟，取超声后溶液过滤即得。

2.方法学验证

2.1专属性

取xxxx对照品溶液作为定位溶液。取空白溶液、定位溶液、空白棉签溶液，分别进样，记录色谱图。要求空白溶液及空白棉签溶液对待测峰无干扰。待测峰与相邻峰分离度大于1.5。

2.2 定量限

取xxxx对照品溶液进样，记录色谱图，根据测出的信号与基线噪音比，将对照品溶液逐级稀释，至信噪比(S/N)约为10时的浓度为定量限。按定量限浓度，重复配制6份溶液，分别进样，记录色谱图。要求6次所得的色谱图中待测物峰面积的相对标准偏差（RSD%）不得大于15%。

2.3 检测限

取xxxx对照品溶液进样，记录色谱图，根据测出的信号与基线噪音比，将对照溶液逐级稀释，至信噪比(S/N)约为3时的浓度为检测限。

2.4 线性与范围

精密称取xxxx对照品约xxmg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为xxxx对照品贮备液，分别精密量取0.2ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2.0ml对照品贮备液置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配制成20%、50%、100%、150%、200%擦拭限度的线性溶液，取各线性溶液与定量限溶液共同组成系列线性溶液。以对照品溶度为横坐标，以对照品溶度对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，要求相关系数R2数值不低于0.9900，y轴截距应在100%响应值的25%以内，响应因子(A/C)的相对标准偏差（RSD%）不得大于10.0%。

2.5仪器精密度

精密量取xxxx对照品溶液注入高效液相色谱仪，连续进样5次，记录色谱图。待测物峰面积的相对标准偏差（RSD%）不得大于10%。

2.6准确度

在10*10cm的区域内均匀涂布擦拭限度值80%、100%、120%的xxxx供试品溶液，每个溶液3份，待溶剂挥干后，用2个棉签擦拭，每个棉签分别先横向蛇形擦拭，再翻转棉签纵向蛇形擦拭，之后将2根擦拭棉签放入具塞试管中，精密加入水10ml，密封，超声10分钟，取超声后溶剂过滤，作为回收率溶液；取回收率溶液进样，记录色谱图，计算样品的回收率，要求待测物回收率不低于70%，9个回收率相对标准偏差（RSD%）不大于20%。

2.7重复性

取供试品溶液，共六份，分别进样。以仪器精密度中对照品溶液计算供试品溶液中待测成分的擦拭回收率。要求待测物擦拭回收率的相对标准偏差（RSD%）不得大于15%。

2.8中间精密度

取供试品溶液，共六份，分别进样，记录色谱图。以仪器精密度中对照品溶液计算供试品溶液中待测成分的擦拭回收率。要求换人、换仪器测定，要求连同重复性12份待测物擦拭回收率的相对标准偏差（RSD%）不得大于20%。

2.9溶液稳定性

取对照品溶液于室温放置0、1、2、4、8、12h分别进样，记录色谱图。要求各时间点峰面积的相对标准偏差（RSD%）不得大于10%。视为溶液室温放置稳定。

取供试品溶液于室温放置0、1、2、4、8、12h分别进样，记录色谱图。要求各时间点峰面积的相对标准偏差（RSD%）不得大于10%。视为溶液室温放置稳定。