人参皂甙Rg3对胰岛素样生长因子-Ⅰ基因敲除鼠乳腺癌组织血管生成相关基因的影响

一、 材料和方法

本实验所采用的肝脏特异性IGF-1基因敲除(LID)小鼠种鼠由美国国家卫生研究院LeRoith教授提供。新生小鼠经基因鉴定得到LID鼠及对照鼠，均为未交配雌性小鼠。对照鼠随机分为第1组和第3组，LID鼠随机分为第2组和第4组，每组各25只，每笼5只。

7,12-二甲基苯蒽(DMBA)购自美国Sigma公司，用于诱导建立小鼠原发性乳腺癌模型。人参皂甙Rg3(纯度99.5%)由长春亚泰制药有限公司提供。小鼠血清IGF-Ⅰ检测试剂盒购自美国ADL公司。DNA提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。基因芯片为美国Affymetrix基因表达谱芯片。

待实验小鼠取鼠尾组织提取DNA通过PCR方法扩增Cre基因，采用琼脂糖凝胶电泳定性分析，Cre基因阳性者为LID鼠，反之为对照鼠。

4组小鼠均自4周龄起开始饲以含15%玉米油的小鼠全营养饲料至实验结束，自6周龄起，各组小鼠均以14号管饲针经消化道喂以0.1ml含DMBA的玉米油，1次/周，连续8周。此外，第3组和第4组小鼠同时管饲GSRg30.3ml，1次/d，连续28d。每天观察各组小鼠的健康状况，每周记录小鼠体重、食量及乳腺肿瘤生长情况。

按试剂盒说明书操作，设标准品孔6孔，每孔中标准品浓度分别为0、5、10、25、50、100ng/ml。波长450nm处读取各孔的吸光度(A)值描画标准曲线，根据测试孔A值得出相应样品浓度。

参考芯片分析的一般要求，共制作6张芯片，第1～4张分别为第1～4组小鼠乳腺肿瘤组织；第5张为第1组小鼠乳腺正常组织；第6张为第2组小鼠乳腺正常组织。每张芯片均由3只小鼠组织标本的混合样本制作，以减少个体间差异对实验的影响。

实验数据以x±s表示，经由计算机采用SPSS12.0软件进行统计分析，率的比较采用卡方检验，其他组间比较采用SNK法方差分析，以P<0.05为差异具有显著性意义。

二、结 果

4组小鼠血清IGF-Ⅰ水平依次为(166.51±12.32)、(41.33±7.52)、(153.84±11.34)、(33.48±6.73)μg/L。第2、4组小鼠的IGF-Ⅰ水平仅为第1、3组的1/4左右。

低血清IGF-Ⅰ水平的小鼠，其乳腺癌发生率、发生时间及生长速度均低于正常水平的小鼠。小鼠乳腺肿瘤肉眼观：球状或不规则结节状，和周围界线分明，质韧，呈黄白色，切面呈分叶状或囊状。经苏木精-伊红染色，病理诊断为乳腺癌。

(1)各组小鼠乳腺癌发病率　

4组小鼠各25只于DMBA管饲过程中，第1组有4只小鼠死亡，第2组有1只小鼠死亡，其余两组小鼠未见死亡。第1～4组小鼠乳腺癌发病只数分别为14、8、9、3只；发病率分别为66.67%、33.33%、36.00%、12.00%；乳腺癌发病率第1组高于其他3组(均P<0.05)，第4组低于第3组(P<0.05)，而第2组与第3组及第4组之间差异没有显著性意义(均P>0.05)。

(2)各组肿瘤平均直径　

各组肿瘤均表现为持续性增大。第1组肿瘤增大速度比其他各组迅速，而第4组肿瘤则生长缓慢。收集标本后测得，4组肿瘤平均直径分别为(0.79±0.20)、(0.37±0.10)、(0.32±0.08)、(0.15±0.05)cm，第1组肿瘤直径显著大于其他各组(均P<0.01)，第4组肿瘤直径则小于其他各组(均P<0.05)。2、3两组间差异没有显著性意义(P>0.05)。

(3)各组小鼠乳腺肿瘤发生个数比较　

4组分别为(2.07±1.00)、(1.50±0.76)、(1.44±0.73)、（1.00±0.00)个。第1、2、3组均表现出多发性，发生肿瘤的乳腺多于1个，第4组仅1处乳腺发现肿瘤。第1组与第4组间差异具有显著性意义(P<0.05)，其余各组之间差异无显著性意义(P>0.05)。

(4)首次发现肿瘤时间　

4组首次发现肿瘤时间分别为(7.62±1.76)、(9.38±1.69)、(9.44±2.30)和(11.33±0.30)周。第1组发现肿瘤时间显著早于其他各组(均P<0.05)，而第2、3、4组之间首次发现肿瘤时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

三、结 论

GSRg3可能通过上调THBS-1、Col18a1发挥抗肿瘤作用。但不能明确这些血管抑制因子与IGF-Ⅰ的关系，亦可能提示THBS-1、Col18a1不通过IGF-Ⅰ发挥对血管生成的抑制作用。IGF-Ⅰ从多方面促进肿瘤发生发展，并且与肿瘤转移之关键——新生血管的形成有着密切的关系。此研究结果对于探讨肿瘤的发生机制及抗血管生成药物在抗肿瘤方面的应用均有指导意义。