代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是一种慢性肝脏炎症，可发展为肝硬化和肝癌等疾病，在我国发病率高，严重危害人类生命健康。有抗炎、抗纤维化作用的重组蛋白和多肽类药物，如松弛素relaxin（RLN）、IL-10等在临床前研究中具有治疗潜力，但这些蛋白质疗法往往因清除速度快、稳定性不佳且缺乏靶向性而很难实现临床转化。
在MASH的病理状态下，代谢功能障碍引起的脂肪性肝炎会激活肝星状细胞（HSC），导致细胞外基质（ECM）的过度沉积并形成药物递送的屏障，大大影响药物的递送效率，导致目前MASH的治疗严重受限。因此，开发靶向递送治疗性抗纤维化蛋白并延长它们在纤维化病变中的保留的策略对于MASH治疗至关重要。
脂质纳米颗粒（LNP）递送mRNA疗法在编码治疗性蛋白以及肝脏靶向上具有显著的肝脏疾病治疗潜力。然而，MASH病理状态下常表现出毛细血管化和肝窗封闭，结合过度沉积的ECM共同限制了LNP-mRNA药物向肝脏的有效递送。
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2024年8月27日，北京大学药学院苗蕾团队在Nature Communications上发表了题为“RNA nanotherapeutics with fibrosis overexpression and retention for MASH treatment”的研究论文。团队利用肝星状细胞摄取和储存视黄醇类似物的特性，将四类视黄醇类似物（①天然视黄醇类；② 天然视黄酸类；③人工修饰的芳香性视黄酸类以及④视黄醇、酸的酯衍生物）引入到LNP配方中，并设计优化了一系列工程化后可锚定于ECM的治疗性RLN融合蛋白。
研究显示，静脉注射基于视黄酸的mRNA-LNP所表达的RLN融合蛋白能够显著延长在肝脏纤维化病灶中的滞留时间并减少系统毒性，以此首次提出了纤维化病灶高表达与长滞留（Fibrosis Overexpression and Retention，FORT）策略，展现了良好的临床应用潜力。
图1. FORT策略示意图
视黄酸LNP显著改善mRNA的纤维化病灶表达
团队首先测试了基于ALC-0315、SM-102和MC3的上市标准LNP配方在野生型（WT）或慢性肝炎模型动物模型中的递送效果。通过静脉注射编码荧光素酶 （mLuc）的mRNA-LNP检测荧光表达发现，纤维化模型中所有3种市售LNP递送的mLuc表达较WT对照降低了6-20倍（图2a-c）。
肝星状细胞主要负责类维生素A的储存，视黄醇和特定视黄醇代谢物可通过视黄醇结合蛋白RBP-4的相互作用增强HSC的摄取。因此，团队在ALC-0315 LNP标准配方中尝试掺入了4种类视黄醇衍生物，包括（I）具有羟基末端的天然视黄醇类（视黄醇、芬瑞肽和4-酮视黄醇）；（II）具有羧基末端的天然视黄酸类（全反式维甲酸ATRA、13-顺式维甲酸13-CRA和9-顺式维甲酸9-CRA）；（III）在环己烷环区域具有芳香族修饰的视黄酸类（阿维A酸A-VA和贝沙罗汀）以及（IV）视黄醇、酸的酯衍生物（乙酰视黄醇和阿维A酯），以此构建了一个用于纤维化肝脏HSC递送的LNP文库。由于类视黄醇衍生物具有疏水性环己烷/芳香环和烯烃链，可以直接掺入LNP的脂质双层中，在胆固醇成分中以5 mol%至25 mol%包含在内（图2d）。
图2. 视黄酸LNP显著改善mRNA的纤维化病灶表达
活化aHSCs（LX-2细胞系）和原代肝细胞（WT和脂肪变性）中的转染效率研究显示，掺入羧酸视黄醇衍生物（ATRA、13-CRA和9-CRA，II组）可显著增强aHSC中的mRNA递送，其表达呈掺入比例依赖性增加，在比例达到25 mol%时表达分别增加了5.4倍、4.1倍和4.2倍。A-VA和贝沙罗汀（III组）在aHSC中显示mRNA递送增加5.3倍和4.7倍，并在~15 mol%较低的掺入水平下趋于稳定。然而，视黄醇衍生物和酯衍生物（I和IV组）在aHSC中仅显示出较标准配方相当或降低的mRNA表达（图2e）。这些LNP均未在健康或脂肪变性原代肝细胞中观察到蛋白质表达增强。
基于上述结果，团队进一步制备了含有ATRA、贝沙罗汀、A-VA和视黄醇25 mol%替代胆固醇的类视黄醇衍生物LNP（RD-LNP），并将ALC-0315标准配方作为对照。表征研究显示，所有制剂的粒径均在100 nm左右，多分散系数小于0.1，包封率大于90%，带轻微负电荷（表1）。
表1. RD-LNPs表征参数
CCl4预处理的小鼠中注射后4周，观察到ATRA、A-VA和贝沙罗汀LNP显著改善了mRNA在纤维化肝脏中的荧光素酶表达，ATRA-LNP显示出最高的表达效果，与 LX-2 细胞系中的体外转染结果一致，突出了基于视黄酸衍生物的LNP（特别是ATRA-LNP）在纤维化肝脏中靶向aHSCs的能力（图2f,g）。
融合蛋白和mRNA的设计
在mRNA编码的抗纤维化多肽药物松弛素（RLN）的基础上，团队添加了11种内源性蛋白质的胶原蛋白结合结构域（CBD），以进一步将表达的RLN锚定在肝脏纤维化病变区域内，并针对胶原结合能力进行了评估。
所有融合蛋白均表现出相似的表达水平。其中来源于胎盘生长因子-2（PLGF-2）的Pep K-CBD使得表达的RLN与ECM蛋白产生强烈的结合，而同样插入PLGF-2其他结构域未显示出胶原蛋白的结合，表明其CBD结合域具有特异性结合特性。
为进一步增强RLN-CBD融合蛋白的胶原蛋白结合能力，将PLGF基序从1个单位扩展到3个单位，设计了两种新的融合蛋白：RLN-PLGF1和RLN-PLGF3。当用ATRA-LNP递送这些mRNA时，RLN-PLGF3与其他三种蛋白相比，表达水平较低，同时没有提高胶原蛋白结合能力（图3c,d）。相比之下，RLN-PLGF1的胶原蛋白结合能力显著优于天然RLN、RLN-PLGF1和IgG Fc融合RLN（图3e）。最为重要的是，游离RLN和RLN-Fc在注射后6天内的炎性细胞因子如IL-6、IFN-γ的水平显著升高，而RLN-PLGF1炎性细胞因子水平较低，具有更轻微的全身毒性（图3j,k）。
图3. 融合蛋白及mRNA的合理设计及验证
mRLN-PLGF1+ATRA LNP的MASH模型治疗效果
接下来，团队将优化筛选后的mRLN-PLGF1+ATRA LNP，在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型及蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型中进行了治疗效果的评估。研究显示，mRLN-PLGF1+ATRA LNP治疗组表现出较未修饰RLN-LNP组更好的治疗效果，显著降低了肝纤维化导致的胶原蛋白覆盖和AST/ALT水平，有效清除了MCD诱导小鼠模型中的脂滴（lipid droplets）。基因表达谱显示，mRLN-PLGF1+ATRA LNP组明显减少了炎性细胞因子如 IL-1β、IL-6的产生。
这些结果表明，mRLN-PLGF1+ATRA LNP能够通过影响纤维化和脂质生物合成途径有效重塑MASH微环境。基于这一治疗优势，团队进一步将FORT策略拓展至抗炎蛋白药物IL-10在MASH中的应用，验证了蛋白替代联合疗法的可行性。
在胆碱缺乏高脂饮食（CDHFD）诱导的MASH仓鼠模型中，mRLN-PLGF1和mIL-10-PLGF组合疗法显著改善了肝纤维化和炎症。有趣的是，mIL-10-PLGF作用于降低循环中的总胆固醇/三酰甘油（TC/TG）水平，而mRLN-PLGF1在下调肝脏脂肪和纤维化进展方面更有效，表明两种疗法之间存在潜在协同作用。联合疗法显示出对脂肪生成基因SCD1和SREBP1C的轻微抑制，同时诱导了促纤维化因子的减少。这些结果突出了应用多种FORT蛋白以实现协同效应并促进MASH恢复的可行性（图4）。
图4. FORT组合疗法具有显著协同作用
总结
该研究从蛋白的体内表达和病灶滞留两方面出发，构建了一种显著提升局部蛋白药物作用浓度和时间的递送策略。这一成果不仅为MASH提供了高效的治疗方案，同时作为一种设计理念，为多种难以实现蛋白递送的深部脏器疾病或局部微环境的治疗带来希望。
参考资料
Shan, X., Zhao, Z., Lai, P.et al. RNA nanotherapeutics with fibrosis overexpression and retention for MASH treatment. Nat Commun 15, 7263 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-51571-8
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