免疫沉淀技术之染色质免疫共沉淀（ChIP）

作为一种研究蛋白质与DNA相互作用的技术，ChIP可以完整真实地反映细胞中特定蛋白与DNA的结合关系，它通过多种蛋白质组学和分子生物学方法，包括交联、细胞裂解（蛋白质-DNA提取）、核酸剪切、抗体免疫沉淀、DNA样本回收，将蛋白-DNA复合物分离出来进一步研究特定的结合蛋白或与其结合的DNA，同时结合qPCR（ChIP-qPCR）可用于检测已知蛋白与特定结合位点的DNA是否结合以及结合的强度，结合二代测序（ChIP-seq）可用于分析目标蛋白在全基因组内的结合情况，用于下游基因的发掘。

利用ChIP检测特定的转录因子在基因组中的结合位置及序列，可发现下游基因的顺式调控元件，从而帮助完善转录因子参与的信号通路。

ChIP可用于检测RNA聚合酶II以及其他转录组分的结合位点，从而发现启动子和增强子的序列，同时也可能发现新的转录调控机制。

ChIP研究在组蛋白密码的发现和表征方面起着关键的作用，通过ChIP可发现组蛋白特异性修饰的水平，同时也可明确组蛋白的修饰对基因的调控作用。

由于不同公司的ChIP实验试剂盒操作细节不同，根据所使用的试剂盒进行实验操作即可，这里整理的一般实验过程，方便大家对整体实验步骤了解。

ChIP实验流程和分析方法^[1]

首先取适量细胞，胰酶消化后加入含 1% 甲醛的 Extraction Buffer 中，37℃孵育15-30min。交联完成后，加入 2ml 2M 甘氨酸，使其终浓度为 0.125M，混匀后继续等待5min，终止交联反应。最后吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次，离心5 min收集细胞。

ChIP检测首先需要将蛋白质-DNA复合物固定，这一步骤对时间要求严格并且需要优化。体内共价交联稳定蛋白质-DNA相互作用并于特定时间点进行分析，通常采用1%甲醛交联，固定时间需要注意，时间过长会导致染色质难以切断且得不到合适的长度，时间过短可能会导致固定不足；之后可以加入甘氨酸以终止反应。交联剂渗透到完整细胞中并将蛋白质-DNA复合物锁定在一起从而进行分析。交联剂在整个过程中保持复合物稳定，但其作用必须是可逆的才能用于ChIP。一些非常稳定的蛋白质-DNA相互作用则不需要交联。

从细胞或组织中提取交联蛋白-DNA复合物，让它们进入溶液。在这个阶段，通过去污剂溶液溶解细胞膜，从而释放细胞组分。由于蛋白质和DNA的相互作用主要发生在核内，去除胞浆蛋白有助于减少背景和提高灵敏度。去污剂或盐的存在不会影响蛋白质-DNA复合物，因为在第一步中实现的共价交联将在整个ChIP过程中保持复合物的稳定性。不建议对细胞进行机械裂解，因为这会导致效率不高的核裂解。

接下来，使用裂解液透化细胞膜，释放细胞组分，然后蛋白质-DNA复合物变得可溶。去除细胞溶质蛋白以减少背景信号并增加灵敏度。

注意：此时可以停止ChIP测定，将裂解物于-80℃储存。

提取步骤产生所有核材料，包括未结合核蛋白、全长染色质和交联蛋白-DNA复合物。为了分析蛋白质结合序列，提取的基因组DNA必须被剪切成更小的可行片段。DNA裂解通常是通过机械的超声波或微球菌核酸酶（MNase）消化来实现的。

细胞核材料片段化是获得良好的ChIP分辨率的关键因素，理想的染色质片段范围在200到1000bp之间；然而，DNA剪切是最难控制的步骤之一。超声波提供真正随机的片段，但局限性包括可能需要协调一致的专用设备、超声波过程中难以保持温度、延长的实际操作时间和更多的优化步骤。用微球菌核酸酶进行酶消化具有高度的可重复性，更适合于处理多个样品，但由于酶活性的变化和酶对核小体间区域具有更高的亲和力，该消化过程可能导致变异。

注意：此时可以停止ChIP。经过剪切/消化染色质后，可以将样品于-80℃储存。避免反复冻融。

将目的蛋白的特异性抗体固定在磁珠上，与蛋白－DNA复合物在4℃摇床孵育过夜，离心去上清后得到蛋白－DNA复合物；然后用洗涤缓冲液洗涤沉淀物三次，每次洗涤后需离心去上清。

选择合适的抗体是ChIP实验成功的关键步骤。多克隆抗体具有识别多个表位的优点，但是其批次差异较大并且来源有限；重组单克隆抗体几乎消除了批次之间的差异并且来源广泛，但它们可以识别的蛋白质构象有限。如果针对某些靶标没有可用的抗体，则可以使样品表达与亲和标签（HA、Myc、His等）融合的蛋白质，然后使用针对亲和标签的抗体进行免疫沉淀。

首先洗脱DNA-蛋白质复合物，并释放DNA：可采用各类Washingbuffer进行一次快速5min洗涤，最后加250μLElutionbuffer，65℃水浴15min，洗脱后吸取上清。将上清中以及Input加入20μL5MNaCl，65℃水浴，解交联6h以上。解交联后，可以在室温下进行DNA的回收和纯化，然后对回收的DNA进行浓度测定。

为了获得更纯的DNA样品，建议使用RNaseA进行处理。从剩余的蛋白质中纯化DNA时，应使用苯酚:氯仿提取或离心柱进行DNA纯化。

注意：此时可以停止ChIP。经过解交联和/或DNA纯化后，可以将样品于-20℃储存。

纯化得到的DNA通过ChIP-qPCR定量测定其水平，也可以通过ChIP-seq进行分析。

ChIP实验操作看相对简单，但是实验耗时长，通常需要至少一周的时间完成一次实验，过程繁琐，每一步都很考验实验操作技术，所以看似简单的实验其实需要注意的事项很多。工欲善其事，必先利其器，下面我们一起来看下具体有哪些值得注意的问题吧。

（1）InputDNA组：超声使染色质断裂后，得到未进行IP且经解交联的DNA。InputDNA是检查ChIP实验效率的参照，所以InputDNA对照是必须要设置的。

（2）阴性对照组：一般将IgG设置为阴性对照，即在ChIP样本中加入IgG抗体。

（3）阳性对照组：阳性对照一般使用已知与DNA序列结合且保守的蛋白抗体，例如H3组蛋白抗体或RNApolII抗体。

不同实验条件和细胞类型，进行甲醛交联的时间和交联剂类型都不同，通常需要摸索优化。根据经验，一般使用1%的甲醛浓度进行交联，室温固定10-15分钟。时间太短的话，交联反应进行的不彻底，很多蛋白与DNA的结合不是很牢固，交联时间太长的话，会导致后续超声非常困难，而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构，进而导致ChIP结果不理想。

体内交联传统上是用甲醛实现的，但可以与其他交联剂如EGS和DSG结合使用。甲醛交联是两种直接相互作用的分子的理想选择。然而，甲醛是一种零长度的交联剂，限制了其功能性。对于更高阶相互作用，较长的交联剂如EGS(16.1Å)或DSG(7.7Å)可以捕获具有复杂四元结构的较大蛋白质复合物。研究人员经常使用交联剂的组合来捕获蛋白质-DNA相互作用。这些交联剂直接渗透到完整的细胞中，有效地将蛋白质-DNA复合物锁在一起，即使是短暂的相互作用复合物也能被捕获并稳定下来进行分析。

（1）ChIP实验所用细胞数量过多，将直接导致甲醛交联时间增加，切断染色质的过程中易造成裂解的DNA片段超过1000bp，这些片段极易丢失，进而导致实验失败。最佳的DNA片段长度是200bp-1000bp。相反，如果过细胞数量太少，切断的DNA片段极可能小于100bp，或样本量不足。实验细胞用量多少合适，最好进行预实验摸索。

（2）不同类型的细胞有不同严格程度的裂解要求，可在显微镜下比较样品前后变化，检查细胞裂解的效率。

（3）保持细胞状态良好，避免更多的因素影响细胞中蛋白与染色质的结合。

（1）ChIP实验首选用ChIP级抗体，是实验成功的关键因素。ChIP级抗体识别的蛋白表位与WB和一般IP实验是有区别的，并且能够耐受高盐、低盐及多种去垢剂的洗涤。如果目标蛋白没有对应特异性抗体可用，除了定制抗体外，还可以给目标蛋白融合标签，通过标签蛋白检测目标蛋白。

（2）抗体浓度做梯度测试，实现最佳的信噪比。

（1）超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且应将脉冲限制在30秒以内，保证低温，以避免蛋白质因过热而变性。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生气泡。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。不同细胞超声条件不同，首次操作需根据样品细胞系优化片段化条件。

（2）若超声时出现泡沫，立即停止超声，至于冰上。之后用冷冻离心机高速离心1分钟去除泡沫，继续超声。还可以通过降低超声功率来防止起泡。

ChIP-qPCR实验一般瞄准的是基因的启动子区域，这一部分相对于基因翻译区，信息要模糊的多，可以通过NCBI上的gene browser来辅助分析，一般可以在转录起始位点（TSS）上游100~1000bp选择，同时需要至少设计两对引物，从中选择效果较好的。

以上即是本期的主要内容，从实验原理、一般实验流程和注意事项几个方面来详细介绍ChIP实验，希望能对大家的实验有帮助。下期将继续介绍免疫沉淀相关的技术—RIP，感兴趣的小伙伴可以关注下~汉恒专注病毒包装十余载，如有技术问题或产品订购需求，欢迎随时咨询！

[1]CollasP.Thecurrentstateofchromatinimmunoprecipitation.MolBiotechnol.2010May;45(1):87-100.doi:10.1007/s12033-009-9239-8.