AAV在肾脏疾病研究中的靶向策略

肾脏疾病是威胁人类健康的主要疾病之一，全球约有13%人口受其影响。目前对肾脏疾病的干预措施包括透析和肾脏移植，这些措施的效果或可用性有限，并且通常会引起各种并发症如心血管疾病和免疫抑制等。因此，迫切需要为肾脏疾病开发新的治疗方法。值得注意的是，高达30%的肾脏疾病病例是由单基因疾病引起的，故基因药物治疗可能对此有所帮助；但由于肾脏结构和功能的复杂性，针对肾脏疾病的基因治疗的研究和开发滞后于肝脏、神经肌肉和眼睛等，目前还没有任何一种针对肾脏的基因治疗药物获批上市。AAV是目前体内基因治疗最合适的载体，已有研究人员利用AAV进行体内外肾脏的基因递送研究，并取得一定的成果。我们相信如何用AAV靶向肾脏是部分老师关心的重点问题。本文将详细介绍肾脏研究中针对不同细胞，如何选择不同的血清型和启动子，以及AAV导入肾脏的方式，希望能够帮助从事相关研究的老师获得有用的实验信息，节约宝贵的时间。

关于肾脏

肾脏是位于脊柱两侧的一对豆状器官，人类的肾脏大约有拳头大小，重约150克。肾脏的主要功能是过滤血液，去除废物和多余的液体，形成尿液。肾脏的内部结构可以分为两个主要部分：皮质和髓质。肾皮质位于外层，是肾小球和肾小管的主要分布区域；肾髓质位于内层，由多个肾锥体组成，每个肾锥体的顶端称为肾乳头。肾锥体的尖端汇集成肾小盏，最终形成肾盂，连接到输尿管，将尿液送往膀胱。肾单位（nephron）是肾脏的基本功能单位，每个肾脏约有一百万个肾单位。每个肾单位包括肾小体和肾小管两大部分。肾小体由肾小球和包围它的肾小囊（Bowman囊）组成。肾脏有多种细胞类型，主要包括内皮细胞、足细胞、系膜细胞、近端小管细胞、远端小管细胞、髓袢细胞、间质细胞等，它们在肾脏不同部位发挥特定的功能。

图1. 肾脏结构示意图和肾皮质的纤维结构¹

图2. 肾脏的主要细胞类型2

靶向肾脏不同类型细胞的AAV血清型

图3 不同AAV血清型对肾脏的靶向性³

导入方式为肾皮质注射，1012 gc/只，体积为50-100μl。

我们根据文献报道和实践经验总结了肾脏研究中常用的AAV血清型：

细胞类型	血清型
肾小球上皮细胞	AAV9
肾小球系膜细胞	AAV9，AAV8
肾小球内皮细胞	AAV9，AAV8
肾小管细胞	AAV9，AAV6，AAV2
间质成纤维细胞	Anc80
足细胞	AAV9, AAV-LK03
全肾	AAV9

肾脏研究中常用的启动子型

启动子名称	启动子特异性
CMV	广谱启动子
ECAD	集合管细胞启动子
SGLT2	近端小管启动子
KSPC	肾脏启动子
hNHPS1	足细胞启动子

AAV导入肾脏的方式4

AAV导入肾脏的方式	AAV分布	特点	病毒参考剂量
尾静脉注射	全身大多数器官均可感染	操作简单，病毒剂量大	5E+11~1E+12vg
肾静脉注射	皮质和髓质中，主要在肾小球和近端小管中	难以突破肾小球屏障，感染效率较低	1E+11vg
肾动脉注射	近端小管和肾集合管	技术难度大	/
肾皮质注射	仅限于注射针头周围	操作相对简单	1.5-3ul/位点
输尿管逆行注射	肾脏管道系统	突破肾小球屏障，操作难度大	1E+11vg
经肾皮质向肾盂注射	皮质和髓质的肾小管上皮细胞中，主要是集合管细胞	操作简单，感染效率高	5E+10vg

AAV在肾脏疾病研究中的应用

案例一、AAV基因疗法治疗由NPHS2基因突变引起的肾病综合征⁵

足细胞是肾脏中的一种细胞类型，其基因突变（如NPHS2基因）是儿童遗传性肾病综合征的常见原因。这篇文章旨在探索用AAV基因疗法治疗由NPHS2基因突变引起的肾病综合征。

实验设计

AAV-LK03和AAV 2/9的选择：研究者比较了AAV-LK03和AAV 2/9两种血清型在人类和鼠类足细胞中的转导效率。
体外实验：通过体外培养的突变人类足细胞中来测试基因疗法的效果。
体内实验：在诱导型足细胞蛋白（Podocin）敲除小鼠模型中测试疾病诱导前（预防性）的基因治疗效果，在诱导型突变Podocin敲入小鼠中测试疾病诱导后（治疗性）的基因疗法效果。

图4 体内实验设计示意图

实验结果

AAV-LK03的高效转导：在体外实验中，AAV-LK03是人类足细胞的高效转导剂。
功能恢复：AAV-LK03介导的足细胞蛋白在突变人类足细胞中实现了功能恢复。
预防性策略的效果：在诱导型Podocin敲除小鼠模型中，AAV治疗组小鼠的尿白蛋白/肌酐比（ACR）、血清肌酐和尿素水平显著降低，血清白蛋白水平有所升高。肾组织显示出较少的肾小球硬化和间质纤维化，与生理盐水组相比，AAV治疗组的肾小球足突结构较为正常。

图5 接受生理盐水或AAV处理的Pod-rtTA TetO-Cre NPHS2fl/fl小鼠的肾脏组织学和存活情况，这些小鼠在疾病诱导之前接受了治疗。

治疗性策略的效果

在诱导型突变Podocin敲入小鼠中，AAV治疗组小鼠的尿白蛋白/肌酐比（ACR）显著降低，血清白蛋白水平有所升高，血清肌酐和胆固醇水平没有显著变化，肾组织显示出较少的肾小球硬化和间质纤维化，足突结构恢复较好。

本篇文章体外实验AAV的导入方式
细胞系选择	Conditionally immortalized human Pods, mouse podocytes
血清型	AAV-LK03，AAV2/9
转导方式	细胞融合度为50%时加入AAV
MOI	5 × 10⁵

本篇文章体内实验AAV的导入方式
小鼠选择	Pod-rtTA TetO-Cre NPHS2^fl/fl，Pod-rtTATetO-Cre NPHS2^fl/R140Q小鼠
血清型	AAV2/9
注射方式	尾静脉注射
注射总量	1.5 × 10¹² vg/只，约6 × 10¹³vg/kg

案例二、miR-29b用于治疗肾脏纤维化的概念验证⁶

慢性肾病（CKD）是一种进行性疾病，其特征是肾功能逐渐丧失，最终可能导致需要肾脏替代治疗或肾移植。肾脏纤维化是CKD患者几乎普遍存在的一种病理变化。已有研究结果显示miR-29b可以抑制肾纤维化，因此miR-29b替代疗法可能是肾纤维化治疗的有效方法。这篇文章主要研究miR-29b用于肾脏纤维化基因治疗的可行性。

实验设计

确定最适合肾脏靶向基因递送的AAV血清型
体外实验：在正常大鼠成纤维细胞、NRK-49F、TEC和NRK-52E细胞中评估miR-29b对TGF-β1诱导的肾细胞纤维化的影响
体内实验：在UUO小鼠模型中评估miR-29b对肾脏纤维化的影响

实验结果

AAV血清型选择：体外细胞实验结果显示rAAV1、2和6是适合靶向肾细胞的AAV血清型，小鼠体内实验结果显示rAAV6是最合适的载体。
图6 rAAV6载体适合在小鼠体内进行肾脏靶向基因递送
miR-29b对肾脏纤维化的影响：miR-29b在体外抑制了TGF-β1诱导的肾细胞纤维化。在UUO小鼠模型中，rAAV6介导的miR-29b递送可以抑制肾脏纤维化和Snail1的表达

图7 rAAV6介导的miR-29b递送可以抑制UUO小鼠模型中的肾纤维化

本篇文章体外实验AAV的导入方式
细胞系选择	正常大鼠成纤维细胞、NRK-49F、TEC和NRK-52E细胞
血清型	AAV1，2，5，6，7，8，9
转导方式	24孔板，2×10⁹ gc/200 µl/孔

本篇文章体内实验AAV的导入方式
小鼠选择	8周雄性C57BL/6小鼠
血清型	AAV1，2，5，6，7，8，9
注射方式	用29G针头向肾盂内注射
注射总量	5 × 10⁹ vg/只，约6 × 10¹³vg/kg

小派提示

AAV作为肾脏基因治疗的潜力载体，其在针对单基因肾脏疾病的基因治疗研究中已有初步成果，尽管整体进展滞后于其他领域，但潜力与应用前景仍不可估量。派真生物一站式CRO&CDMO服务平台，可为您提供全面的病毒载体包装服务和个性化定制服务。我们的产品线涵盖腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、mRNA，为您的肾脏基因治疗研究提供全方位的支持，欢迎后台留言或点击文末“阅读原文”了解详情。

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