实验干货
2024.07.18
抗生素筛选预实验
抗生素预实验目的是确定抗生素的最佳浓度,同时确定抗生素对所选细胞的最低作用浓度,以便用于病毒感染后通过合适的抗生素浓度进行稳定株构建。
实验步骤(以 Puromycin 筛选为例)
1
细胞培养:取待测培养且状态良好的细胞,制备成细胞悬液,按等量接种入 96 孔培养板中,待细胞生长至70~80%汇合度左右开始加药。
2
加入 Puromycin 药物进行空细胞致死最低浓度筛选,浓度范围一般设置为:1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL 等。
*以上为终浓度,具体浓度设计可参考文献中相关细胞常用浓度并设置梯度,一般设置7~8 个浓度点,并做2~3 复孔
3
药物处理 72h 后细胞全部死亡的最低药物浓度,即为后续 Puromycin 抗性细胞的筛选浓度(全致死浓度),可通过不同浓度加药细胞拍摄图片分析,或酶标仪检测 CCK8 数据分析,建立死亡曲线,确定最佳筛选浓度。
常见抗生素类型及浓度范围推荐
嘌呤霉素盐酸盐Puro(首选) | 使用浓度 1~10μg/mL 作用时间 72 小时 |
杀稻瘟菌素S Blasticidin S (次选) | 使用浓度 5~50μg/mL 作用时间 72 小时 |
遗传霉素G418 | 使用浓度 100μg/mL~1mg/mL 作用时间 10~14 天 |
潮霉素B Hygromycin B | 使用浓度 50-500 μg/mL 作用时间 7-10 天 |
抗生素筛选建立稳转株
带有不同抗性的慢病毒在成功感染细胞后,能使细胞在含有一定浓度对应抗生素的培养基中存活,而未感染上慢病毒的细胞则无法存活。因此在抗性筛选压力下,可成功筛选稳定表达目的基因的细胞株。
如:带有 Puromycin 抗性的慢病毒感染 48~72 小时后(70~80%汇合度),将细胞继续培养于含适当浓度 Puromycin 的培养液中,每 3~4 天更换一次含抗生素的培养液,直至未感染病毒的对照组细胞被抗生素杀光,而感染病毒组再无细胞出现死亡(如病毒载体带有荧光标记,荧光效率需达到 100%)后,进行混合克隆及单克隆稳定株筛选。
注:筛选浓度即为抗生素预实验确定该细胞的全致死浓度,筛选时可设置未感染病毒的野生型细胞作为对照,加入等量浓度抗生素。
吉满抗生素产品
吉满可提供不同规格的嘌呤霉素盐酸盐、杀稻瘟菌素S(灭瘟素)Blasticidin S、遗传霉素G418 Sulfate、潮霉素B(hygromycin B)等抗生素可用于细胞实验中的抗性筛选。
产品名称 | 货号 | 规格 |
嘌呤霉素盐酸盐Puromycin dihydrochloride | GM-040401 | 25mg/100mg/ 250mg/500mg/1g |
遗传霉素G418 Sulfate(Geneticin) | GM-040402 | 1g/5g |
潮霉素B Hygromycin B | GM-040403 | 1g/10g |
杀稻瘟菌素S(灭瘟素)Blasticidin S | GM-040404 | 10mg/5*10mg |
盐酸博莱霉素 | GM-040407 | 100mg/100mg*10 |
吉满引文(部分)
Feng J, Zhong H, Mei S, et al. LPS-induced monocarboxylate transporter-1 inhibition facilitates lactate accumulation triggering epithelial-mesenchymal transformation and pulmonary fibrosis[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2024, 81(1): 206. #GM-040401
Lin Z, Liu Y, Xu T, et al. STAT3-Mediated Promoter-Enhancer Interaction Up-Regulates Inhibitor of DNA Binding 1 (ID1) to Promote Colon Cancer Progression[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(12): 10041. #GM-040404
Jia X, Xi J, Tian B, et al. The tautomerase activity of tumor exosomal MIF promotes pancreatic cancer progression by modulating MDSC differentiation[J]. Cancer Immunology Research, 2024, 12(1): 72-90. #GM-040403
吉满生物科技(上海)有限公司成立于2011年,是专业从事生物科技前沿技术研发的高新技术企业。以病毒包装为基础,密切关注行业最前沿的科研进展,十一年深耕细作,创建了具有自主知识产权的分子生物学、细胞生物学、慢病毒、腺相关病毒、报告基因、抗体表达六大技术平台。
2020年成立了专业细胞系子品牌DDXCELL,提供报告基因检测、病毒包装、工程细胞株构建,基因编辑及药物筛选评价等技术服务及相关产品。
2022年载体品牌“载体通·Genovector”焕新升级,同时推出全新试剂品牌“优试剂·Genoagent”,贯穿科研始末。
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