2024年10月， 研究团队在国际期刊Redox Biol.期刊(IF:10.7)上发表了题为“Neutrophils with low production of reactive oxygen species are activated during immune priming and promote development of arthritis”的研究成果。本研究旨在使用单细胞测序技术彻底分析II型胶原蛋白(COL2)诱导的关节炎(COL2-induced arthritis, CIA)模型中骨髓源性中性粒细胞的表型特征，包括经过COL2初次和加强免疫的小鼠，来识别在免疫启动期间被激活的中性粒细胞亚群，并探索其在关节炎发展中的作用。
新格元在该研究中提供了GEXSCOPE单细胞转录组测序服务以及提供单细胞数据分析服务。
研究背景
类风湿关节炎(RA)是一种由免疫细胞功能障碍介导的炎症性自身免疫性疾病，目前尚无普遍有效的预防和治疗策略。探索RA早期免疫细胞功能障碍的具体机制对于阐明炎症机制和筛选干预目标具有重要的科学意义和临床价值。作为主要的效应细胞中性粒细胞在RA发展过程中炎症性关节攻击中起重要作用。
技术路线
主要研究结果
1.特定的中性粒细胞群的ROS代谢过程在实验性关节炎的发展中至关重要
BM是造血的主要部位，负责产生包括中性粒细胞在内的所有类型的血细胞，对于了解中性粒细胞在RA中的发育和功能至关重要。为了表征免疫启动和关节炎发病期间的中性粒细胞，对初始、免疫启动(第0天)和免疫增强(第21天重复COL2免疫)即关节炎发病期间的骨髓细胞进行了scRNA-seq分析。总共分析了72388个细胞，根据典型标志物的表达确定了10个不同的簇，包括B cells, plasma cells, HSCs, ProEryth,erythroblasts, GMP, neutrophils, basophils, T cells, MPs(图1A,B)。其中，中性粒细胞的比例在初始组和启动组之间差异显著(图1C,D)。然而，没有观察到幼稚组和增强组之间的显著差异，可能是因为增强小鼠的中性粒细胞更有效地募集到炎症部位，这表明中性粒细胞从BM迁移到组织而不通过血管室(图1C,D)。随后，用抗Ly6G抗体耗尽DBA1/J小鼠的中性粒细胞，随后用COL2免疫它们，发现只有中性粒细胞耗尽的小鼠发展为轻度关节炎，这表明中性粒细胞可以防止小鼠在CIA早期发展为关节炎(图1E,F)。为了剖析中性粒细胞的异质性，进一步研究了中性粒细胞相关人群(MPs和中性粒细胞)。无监督聚类将分化中性粒细胞和成熟中性粒细胞分成5个簇(G0-4)(图1G)。同样，初始、增强和原始小鼠的中性粒细胞数量从高到低排列(图1G)。单细胞轨迹分析显示中性粒细胞成熟和分化的时间过程高度一致，显示了中性粒细胞从GO到G4的发育轨迹(图S1D)。此外，观察到初始小鼠中向G4群体分化的细胞数量显著增加(图S1E)。在DEGs的GO分析中，细胞周期相关基因在中性粒细胞成熟的早期阶段(GO，G1和G2)高表达，氧化还原相关基因在噬菌体晚期(G3和G4)上调(图S1F-G)。G4细胞的GO富集分析显示，它们与ROS代谢过程的反应和炎症反应的调节密切相关(图1H)。在G4细胞中，NADPH类酶、ROS生成、趋化性、中性粒细胞激活和成熟评分在关节炎早期阶段显著上调(图S1H)。还发现G4亚群高表达Ncf1,Ncf1是NOX2复合体的重要亚基，负责诱导ROS，进一步支持中性粒细胞ROS的产生主要是由吞噬NADPH氧化酶在关节炎前期介导的(图1I-J)。
图1. 单细胞测序分析关节炎中BM中性粒细胞
图S1. 关节炎中BM中性粒细胞亚群的特征
2.ROS在实验性关节炎的发展中显示出双重作用
在免疫启动过程中，ROS的丢失导致关节炎的发展，关节中中性粒细胞数量增加。相反，在关节炎发病期间，ROS的缺失通过减少中性粒细胞数量来缓解关节炎症状，提示ROS双向调节关节炎(图2)。
图2. ROS在关节炎的早期保护和晚期发病中起双向作用
3.实验性关节炎早期中性粒细胞ROS缺乏会加重关节炎症
抑制NOX2来源的ROS后，初始小鼠对关节炎的易感性更高，表明中性粒细胞来源的ROS是一个重要的调节因子。实验性关节炎早期阶段的ROS缺乏促进中性粒细胞表现出促炎特性，从而促进关节炎的发展(图3)。
图3. ROS缺乏通过在早期募集中性粒细胞引发关节炎
4.ROS缺乏会影响中性粒细胞的功能
ROS缺乏的中性粒细胞通过减少氧化呼吸爆发、钙通量和形态不扩张来自我维持。这种ROS水平的改变导致中性粒细胞功能的改变，主要表现为迁移、跨血管内皮能力和炎症免疫反应的增加，以及吞噬和粘附的减少，以便快速迁移到炎症部位以发挥其作用(图4)。
图4. 缺乏ROS时中性粒细胞功能和炎症表型的改变
5.ROS缺乏的中性粒细胞表现出更强的炎症代谢
在免疫启动环境中，ROS缺乏的中性粒细胞经历表型转变，从与能量代谢和生物降解相关的途径转向炎症和免疫代谢，从而促进炎症(图5)。
图5. ROS缺陷中性粒细胞的炎症代谢重编程
结论
研究发现在免疫初期，ROS的减少导致关节炎的发生，但在免疫增强期，ROS的减少则减轻了关节炎的症状。这表明ROS在RA的发展中具有双向作用。在机制上，Ncf1缺陷的中性粒细胞表现出增强的迁移能力、CXCR2表达、炎症细胞因子分泌和Th1/Th17分化。这种变化主要是由于Ncf1缺陷中性粒细胞的代谢重编程，从以糖异生为主的能源供应途径转变为与组氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸信号传导相关的炎症免疫途径，进而诱导关节炎。
参考文献
Tao Chen , Zhen Zhou , Yi Liu ,et al.Neutrophils with low production of reactive oxygen species are activated during immune priming and promote development of arthritis.Redox Biol. 2024 Oct 18:78:103401. doi: 10.1016/j.redox.2024.103401. Online ahead of print.
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