克氏综合征是男性不育的常见遗传学病因之一
患者表现为较正常男性多一条X染色体
随着辅助生殖技术的发展
部分克氏综合征患者
可以通过睾丸显微取精术获得后代
但仍有近一半的患者无法获得可用精子
几十年来，研究多集中在成人阶段
此时生殖细胞已大量丢失
北京大学乔杰/袁鹏/闫丽盈/魏瑗团队提出
生殖细胞X染色体剂量异常
可能出现在克氏综合征患者的胎儿时期
其很可能是导致发育异常的关键
因此
团队对患者胎儿期的生殖细胞展开了深入研究
揭示了额外X染色体的
活性状态、转录特征和影响生殖细胞发育的机制
10月30日，研究成果发表于Nature
突破性提出
改善克氏综合征患者生殖细胞发育障碍的潜在方法
为患者带来新希望
2024年10月30日，北京大学第三医院妇产科乔杰/袁鹏/闫丽盈/魏瑗团队合作在《自然》（Nature）发表了题为“How the extra X chromosome impairs the development of male fetal germ cells”的研究文章。
△本研究主要作者
生殖细胞的正常发育是维持生育力的根本，北京大学第三医院的乔杰院士团队一直致力于生殖细胞发育调控机制研究。团队的前期工作系统解析了人类生殖细胞从胎儿到成人各阶段的发育特征和调控机制。女性FGC（核型46，XX）中X染色体重新激活导致其X连锁基因的表达剂量显著高于男性（核型46，XY），而男性FGC中的X连锁基因表达剂量不仅低于女性FGC，还低于男性自身的性腺体细胞，提示不同类型的细胞对X连锁基因表达剂量的需求存在差异。
X连锁基因的表达剂量如何调控FGC发育，尤其是当X连锁基因表达剂量异常时如何影响FGC发育，尚不清楚，克氏综合征是研究这一重要科学问题的天然模型。患者核型为47，XXY，较正常男性多一条X染色体，发病率约为1/600，是导致男性不育最常见的遗传学病因之一。克氏综合征患者生殖细胞在青春期前就大量丢失，成年后主要表现为无精子症，伴随着曲细精管纤维化和透明化等睾丸组织病理改变。患者可以通过睾丸显微取精术获得后代，却仍有近一半的患者无法获得可用的精子。
既往研究通常聚焦于已经发生了生殖细胞大量丢失的成年克氏综合征患者，主要揭示了性腺内体细胞的发育异常。但这些体细胞的异常是否与生殖细胞丢失有直接关系尚无定论，相关分子机制一直未被揭示。
团队将目光转向胎儿阶段——袁鹏副研究员说，“克氏综合征患者胎儿期的生殖细胞可能已经出现X染色体剂量异常，并可能是其生殖障碍的分子基础，因此，研究胎儿期的生殖细胞可能是发现发育异常的关键，我们对此开展了深入研究。”
为了平衡女性和男性的性染色体表达剂量，女性两条X染色体会随机失活一条。XIST分子在其中起到关键作用。秦萌博士介绍说，“X染色体剂量异常往往和生殖障碍类疾病相关，比如克氏综合征和先天性卵巢发育不全的Turner综合征等。”
为了了解生殖细胞中X染色体的活性状态，需要实现生殖细胞标志、X染色体失活相关 RNA分子以及X染色体的共同定位。团队开发了蛋白/RNA/DNA三重荧光原位检测技术，成功解决了这一难题。团队发现克氏综合征早期FGC中XIST分子的分布是非常独特的，并将其命名为“星云状（nebular cloud）”分布，其分布面积大，高度紧密，且荧光强度很高。如何精确的去描述其分子分布状态成为另一个问题。秦萌博士介绍说，“我们基于图像分析技术开发了专用软件，从图像维度对相关特征（比如荧光强度、荧光信号最小外接圆的面积）进行精确统计，并构建了一种空间统计学计算模型，最终成功实现了对生殖细胞多种XIST分布状态的精准分类。”
△蛋白/RNA/DNA三重荧光原位检测技术和空间统计学算法
卢永杰博士介绍说，“令人意外的是，克氏综合征患者FGC中强烈的星云状XIST分布并没有导致X染色体失活。此外，我们发现正常女性（46，XX）以及超雌综合征（47，XXX）患者的FGC也不发生X染色体失活。因此，我们提出人类FGC中X染色体重新激活后不再失活。其中，XIST无法结合到X染色体以及XACT对XIST的拮抗作用可能是FGC中X染色体未失活的原因”。
研究发现，在克氏综合征胎儿性腺中，额外的X染色体并不会改变各种细胞的细胞命运，其细胞类型与正常男性性腺相同。团队发现，克氏综合征患者的FGC大多数（约81%）停留在早期阶段（正常男性对照中这一比例仅为15%），其FGC总数与正常男性对照相比没有显著差异，提示克氏综合征患者的FGC发生了严重的发育阻滞，但此时生殖细胞尚未出现明显丢失。团队进一步揭示了额外X染色体导致上述异常的机制：克氏综合征患者FGC中两条X染色体都处于活跃状态，X连锁基因的表达剂量远高于正常男性，导致WNT和TGF-β等通路活性上调，细胞周期过度活跃，阻碍其顺利进入有丝分裂静止阶段（晚期阶段），最终导致FGC发育阻滞。
除了发育阻滞，克氏综合征FGC另外一个关键异常是迁移受损。FGC的发育受到周围体细胞的精确调控，睾丸索中的支持细胞介导了FGC的迁移。妊娠中晚期需要从睾丸索中心迁移到基底部，进一步分化为精原干细胞，从而形成出生后男性的“生精池”。
研究发现克氏综合征胎儿支持细胞也出现发育异常，且与细胞迁移和运动相关的基因下调，导致支持细胞-FGC间参与细胞迁移的SEMA7A-ITGB1、CDH2-CDH2、JAM2-JAM3互作减弱，最终引起晚期FGC和支持细胞向睾丸索基底部的迁移受损。无法正常迁移的FGC将因为无法分化为精原细胞而死亡。
克氏综合征患者FGC中关键基因启动子的甲基化异常也可能是其发育阻滞的原因。DNA甲基化分析结果还提示，克氏综合征早期FGC的全基因组（包括印记基因）甲基化水平降低，而重复元件SVA的甲基化水平升高，这些表观遗传异常的意义有待进一步研究。
△克氏综合征患者FGC发育异常机制示意图
闫丽盈教授和魏瑗教授提出，“作为国家妇产疾病临床医学研究中心及国内顶尖辅助生殖中心，我们承担了科研创新、技术创新、疑难疾病诊疗攻关等一系列重要角色。我们不能止步于仅仅揭示克氏综合征患者生殖细胞发育障碍的机制，还要探索疾病的潜在治疗措施。” 因此，团队利用性腺体外培养体系，进一步探索了挽救克氏综合征FGC发育异常的可能策略。性腺组织体外的成功培养需要严苛的条件，且每次培养周期长达一个多月，经过半年多的摸索，终于实现了性腺组织的体外稳定培养。团队发现，在相同培养条件下，正常男性的FGC在体外能够有效分化，但克氏综合征患者的FGC无法继续分化。通过应用各种小分子化合物尝试改善性腺发育，团队最终发现TGF-β抑制剂能够显著改善克氏综合征患者FGC的分化，这为治疗克氏综合征患者生殖障碍提供了重要线索。
北京大学第三医院乔杰院士表示，“本研究不仅揭示了X染色体剂量异常影响克氏综合征胎儿生殖细胞发育的潜在机制，也丰富了对正常胎儿生殖细胞发育基本规律的理解，最为关键的是还提出了治疗克氏综合征无精子症的潜在新策略。此成果的发表，不仅得益于团队在生殖发育领域长期的研究积淀，更离不开青年科研人才不断探索、勇攀高峰的精神和闯劲。我们将继续深入探究生殖细胞发育的生理和病理机制，为生殖障碍相关疾病的诊断与治疗持续贡献北大力量。”
齐心童博士和花凌月博士整理
过去几年中，乔杰课题组与汤富酬课题组紧密合作，首次在单碱基分辨率和全基因组水平，全面揭示了人类胚胎生殖细胞在多个关键发育阶段的大规模DNA甲基化组重编程过程、及其对基因表达的调控关系，并且发现了人类胚胎生殖细胞不同于小鼠胚胎生殖细胞的关键独特特征。他们发现在DNA甲基化组重编程过程中，DNA甲基化与基因转录调控发生脱扣，这样DNA甲基化在被大规模擦除过程中基因的转录基本不受影响，各种组蛋白共价修饰在此期间维持着转录组的高度稳定性。相关研究成果以封面文章的形式发表在2015年6月的《Cell》杂志上。
而后两个课题组继续深入研究，系统分析了人类胚胎生殖细胞多个关键发育阶段的染色质状态组的动态变化。作为对照，他们也系统分析了对应发育阶段的小鼠胚胎生殖细胞的染色质状态组的动态变化。通过进化比对分析，揭示了人类和小鼠胚胎生殖细胞染色质状态组、DNA甲基化组参与基因表达调控的进化保守性特征以及物种特异性特征。他们还发现了十几万个人类生殖细胞胚胎阶段特异性的开放染色质区域，推测其中大部分为全新的人类胚胎生殖细胞特异性激活的增强子调控元件，这为解析增强子对于人类生殖细胞体内发育的调控机理打下了坚实的基础。相关研究成果已发表在2016年11月的《Cell Research》杂志上。
之后两个课题组对人类胚胎生殖细胞在妊娠4周到26周的长达五个月的发育关键期的转录组进行了深入的解析与阐释，发现人类胚胎生殖细胞的发育进程在时间上是不同步的，会经过一个复杂而有序的异步发育过程。在单细胞水平的系统分析发现在同一个胚胎中的早期阶段生殖细胞与晚期阶段生殖细胞之间通过NODAL等信号通路相互作用，共同维持二者之间的动态平衡，而视黄酸的快速合成与及时降解之间的精确动态平衡对于人类雌性生殖细胞进入减数分裂起重要调控作用。通过后续的功能实验对性腺中生殖细胞的分布与定位、以及细胞亚群的精确比例关系等关键特征进行了系统的分析，加深了对于生殖系-非生殖系细胞在性腺发育过程中的互动与协同调控机理的理解。相关研究成果已发表在2017年4月的《Cell Stem Cell》杂志上。
对于人类雄性生殖细胞进入生殖细胞后的精子发生过程，后续研究首次从单细胞水平系统阐明了人类精子发生过程中的基因表达调控网络和细胞命运转变路径，从睾丸细胞中鉴定出17种细胞类型，揭示了雄性生殖细胞的关键特征基因和发育轨迹。进一步分析发现BMP和FGF信号通路很可能在人类精原干细胞的自我更新过程中发挥了关键作用。对非梗阻性无精症的探索发现患者睾丸组织中细胞凋亡表征明显。以上结果为揭示不育症的致病机制和研发临床诊断策略提供了新的思路。相关研究成果已发表在2018年8月的《Cell Stem Cell》杂志上。
人类雌性生殖细胞发育与雄性具有不同的规律。研究团队进一步绘制了人类卵泡发育过程中转录组动态全景图并解析了卵母细胞-颗粒细胞互作规律，发现卵泡可聚为五个类群，原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡及排卵前卵泡，并与卵泡形态学分类一致。卵母细胞及颗粒细胞各自差异基因表达模式具有显著的发育阶段特征。随着卵泡发育，卵母细胞减数分裂相关基因表达水平总体呈逐步上调趋势。而颗粒细胞有丝分裂相关基因表达水平从原始卵泡到窦卵泡阶段总体呈逐步上调趋势，而从窦卵泡到排卵前卵泡阶段表达下调。Insulin、GnRH、Neurotrophin和mTOR信号通路相关基因在初级卵泡中卵母细胞及颗粒细胞中均显著上调，可能参与原始卵泡阶段到初级卵泡阶段的激活调控，是完善体外卵泡培养体系的潜在靶点。NOTCH信号通路配体DLL3和JAG2主要在卵母细胞中表达，其受体NOTCH2、NOTCH3和下游靶基因HES1在相应的颗粒细胞中高表达，提示NOTCH信号介导了卵母细胞调控颗粒细胞增殖和分化的事件。这是该团队在人类生殖细胞发育研究领域里取得的又一重要进展。相关研究成果已发表在2018年11月的《Molecular Cell》杂志上。
随后，两个课题组对人类胚胎和胎儿中的生殖细胞和性腺体细胞进行系统分析。发现骨形态发生蛋白（BMP）信号通路在睾丸发育中起着细胞类型特异性和发育阶段特异性的作用，并在晚期促进性腺细胞向精原细胞转化。睾丸激素合成功能从胎儿支持细胞逐步过渡到成人间质细胞。特别的是，他们发现一例Turner综合征（45,XO）胚胎在FGC和性腺体细胞中都表现出异常的基因表达谱，并且缺乏正常XX胚胎中存在的一类细胞群。相关成果已经发表在2022年5月的《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》杂志上。
进而，X染色体引起的生殖细胞异常发育引起了课题组的关注。
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来源 | 北京大学融媒体中心、北京大学第三医院、北京大学医学部
编辑 | 孙小婕
排版 | 叶雨青、陈蕾
责编 | 陈蕾
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