Molecular Cancer丨克服胰腺导管腺癌化疗耐药性

接下来，我们一起看看本研究的主要结果。

首先，作者通过活检获取了20例晚期不可切除PDAC患者的肿瘤组织，通过肿瘤影像学和肿瘤标志物糖类抗原19-9（CA19-9）表达的变化将患者分为AG敏感组和AG耐药组，对这些组织的RNA-seq数据进行KEGG分析，结果显示PI3K/Akt信号通路具有最显著变化、且具有最高的富集得分。接着，作者构建了AG耐药PDO模型（PDO-AGR组）和AG敏感PDO模型（PDO-AGS组）以验证两组间的药物耐受性差异。PDO-AGS组在AG处理下显示出更低的IC50值和较低的细胞死亡率，对PDO的RNA测序分析显示PI3K/Akt通路在PDO-AGR组异常激活，表明PI3K/Akt通路的异常激活在PDAC的AG耐药中起关键作用。

由于现有的PI3k/Akt抑制剂具有一定毒性和副作用，不适用于临床应用，而作者团队此前发现已投入临床使用的抗炎药舒林酸K-80003是有效的I3K/Akt通路抑制剂，因此，本次研究探索了K-80003是否具有克服在PDO-AGR组AG耐药性的潜力。在5个AG耐药的PDO模型中，K-80003使其中3个模型（PDO11#，PDO17#，和PDO18#）恢复AG化疗敏感性，AG与K-80003联合治疗显著降低了该PDO-AGR组别的细胞存活率。此外，在建立的PDO原位胰腺癌小鼠模型（PDOX模型）中，与单独使用AG方案相比，联合使用K-80003和AG方案显著减小了肿瘤体积，并延长了相应的PDOX模型的中位生存期。作者使用内部、外部PDO数据库随机选择的耐药PDO构建PDOX模型，AG联合K-80003治疗同样使得部分PDOX模型表现出化疗敏感性，这证明K-80003是一种有效的AG化疗敏感增强剂，但只有一半患者具有治疗效果，表明需要找到合适的反应预测标志物来实现患者分层治疗。

为了探索与K-80003提高AG化疗敏感性能力相关的潜在circRNA标志物，作者对PDO样本的RNA-Seq数据进行分析，筛选鉴定出46个差异表达的circRNA，并对上调/下调变化最为显著的前5个分子进行PCR验证。通过circRNA与PI3K/AKT通路之间关联的基因集富集分析（GSEA）和Pearson相关性分析确定4个circRNA，分别于PDAC细胞系PATU8988T中进行过表达，验证其与吉西他滨（GEM，AG方案中的主要成分之一）和K-80003给药条件下的细胞化疗敏感性是否相关，并进行3D肿瘤微球凋亡染色测定，确定了cFAM124A与GEM敏感性相关度最高。接受GEM化疗的PDAC患者肿瘤组织中的IHC染色和FISH结果显示，与GEM敏感组相比，GEM耐药组中的cFAM124A和p-Akt（Thr308）表达显著上升，二者的变化呈正相关。此外，cFAM124A表达与PDAC患者的的生存率密切相关。以上结果表明只有cFAM124A而非其他上调的circRNA，与GAM相关且可预测K-80003治疗效果。

PI3K/Akt抑制剂K-80003可通过阻止tRXRα与PI3K的p85α亚基结合来抑制PI3K/Akt信号的激活，然而tRXRα的截短蛋白特性使得其不适合作为预测性生物标志物，于是，作者进一步验证p-Akt（Thr308）p-Akt（Ser473）和cFAM124A组织表达差异与K-80003的相关性，以及其对比预测K-80003治疗应答的能力。mIFS染色和IHC染色结果显示PDAC患者K-80003反应组和K-80003无反应组组织中的cFAM124A丰度差异显著，癌症组织中的cFAM124A、p-Akt（Thr308）和p-Akt（Ser473）的表达水平高于癌旁组织中的表达水平。肿瘤相对于癌旁组织的倍数变化值显示，cFAM124A在反应组和非反应组之间具有良好的区分能力，而P-Akt（Thr308）和P-Akt（Ser473）识别效果远不如cFAM124A，这表明cFAM124A是一种实用有效的生物标志物。

为了探究cFAM124A作为预测K-80003药物反应标志物的机制，作者在PATU8988T和MiaPaCa-2细胞中过表达cFAM124A，通过WB检测发现cFAM124A的过表达减弱了PDAC细胞中GEM诱导的细胞凋亡水平，促进了PI3K/Akt信号通路的过度激活，PI3K泛抑制剂（PI3Ki，copanlisib）则抑制了这些变化。CCK-8测定、3D肿瘤微球凋亡染色实验和克隆形成实验等体外实验，以及皮下异种移植模型体内实验结果表明，copanlisib的使用恢复了cFAM124A过表达所导致的GEM耐药性。然而，copanlisib可导致小鼠体重减轻，K-80003对小鼠体重无显著影响，这表明K-80003具有更好的安全性。随后，作者进行了蛋白组学分析和WB检测以探究cFAM124A所调控的下游蛋白质表达变化，结果显示cFAM124A过表达显著激活PI3K/Akt通路，抑制RXRα蛋白表达和降解，最终促进tRXRα（截短型RXRα）的产生。由于RXRα蛋白水解产生的截短蛋白tRXRα与PI3K的p85α亚基相互作用可激活PI3K/Akt通路，作者推测cFAM124A通过tRXRα激活PI3K/Akt通路，导致PDAC中的GEM耐药，而K-80003可以逆转这种作用。

接下来，作者研究了cFAM124A促进RXRα水解的机制，发现CTSL酶抑制剂（Z-FY-CHO），而不是m-钙蛋白酶抑制剂（PD150606），可恢复由cFAM124A过表达引起的RXRα下降和tRXRα增加，而cFAM124A可促进活性CTSL累积。作者通过数据库预测、RNA pulldown-MS鉴定和RIP-qPCR等分析，证实了cFAM124A和胰岛素样生长因子2RNA结合蛋白2（IGF2BP2）之间存在相互作用。通过RNA pulldown和RNA反义纯化（RAP）测定结果证实了IGF2BP2和CTSL mRNA之间的相互作用，cFAM124A过表达增加了IGF2BP2和CTSL mRNA之间的相互作用，导致CTSL mRNA的降解速度变慢。为了确认IGF2BP2介导的CTSL mRNA直接功能域（识别m6A的功能域，KH4）的稳定和依赖cFAM124A的间接促进功能域（cFAM124A结合的功能域，KH1）的功能，作者进一步构建IGF2BP2截断体，证明了cFAM124A结合IGF2BP2，以m6A依赖的方式稳定CTSL mRNA，从而发挥桥接作用。cFAM124A支架位点的突变在mRNA和蛋白水平上完全逆转了cFAM124A过表达诱导的CTSL表达上调，而只能部分逆转cFAM124A过表达引起的CTSL活性、tRXRα水平、p-Akt/Akt表达量以及GEM耐药性增加。CTSL的敲低则完全逆转了cFAM124A过表达导致的tRXRα/PI3K/ATK通路和GEM耐药性变化，这表明cFAM124A还通过其他机制影响CTSL酶活性。

CTSL的活性主要受胱抑素A（CSTA）和胱抑素B（CSTB）调节，为了探究cFAM124A是否也通过该通路调控CTSL活性，作者进行了RNA pulldown-MS分析，并通过免疫荧光、RIP和RNA pulldown实验证明了FAM124A和CSTB之间存在相互作用，cFAM124A的表达显著抑制了CTCL-CSTB相互作用。使用catRAPID数据库预测结合位点，并构建去除了与CSTB结合的竞争位点的cFAM124A截短序列质粒，结果显示在cFAM124A的76-210-nt区域被截断时，circRNA探针捕获的CSTB蛋白显著减少，同时CSTB与CTSL结合的增加。此外，WB、CTSL酶活性检测、3D肿瘤微球染色和集落形成实验的结果显示竞争位点的缺失减弱了cFAM124A过表达所引起的tRXRα的增加、PI3K/Akt通路激活的异常升高和CTSL活性，而cFAM124A支架位点和竞争位点的同时突变则逆转了这些变化。

综上所述，本研究探索了PDAC对AG方案致敏的新治疗策略，证实了抑制PI3K/Akt的成熟药物K-80003的临床潜力，发现cFAM124A通过与IGF2BP2蛋白、CTSL mRNA结合来形成更稳定的复合物，并通过与CSTB蛋白结合来负向调节CTSL蛋白酶的活性，是预测PDAC中K-80003克服AG化疗耐药能力的最佳生物标志物。