吉玛AAV研究指南-肠道篇

肠道是人体重要的消化器官。肠指的是从胃幽门至肛门的消化管，是消化管中最长的一段，也是功能最重要的一段。哺乳动物的肠包括小肠、大肠和直肠3大段。免疫系统和解毒系统，如肝、血清、淋巴系统等，都需要肠道提供的营养。从这个意义上说，肠道是人体最大的免疫器官，有将近70%以上的免疫细胞分布在肠黏膜上，肠道运动支持了整个生命活动。

目前已有很多利用重组腺相关病毒（rAAV）病毒载体进行肠道基因治疗的临床前研究数据，主要集中在粘膜转导方向。由于肠道管腔条件恶劣导致rAAV的有效侵染率较低。

本文将详细介绍在肠道研究中AAV的推荐使用方法，包括血清型和启动子的选择，几种常用的肠道注射方法并提供详细的文字描述和视频教程。

根据文献资料和研究实际经验，AAV2、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10对肠道组织的转导效率较高，其中AAV7对小肠的感染效率相对较高，AAVrh10已被证明能够在肠道中长效表达外源基因，尤其是在结肠中，目前研究中应用较多的血清型是AAV9。

肠道研究中，通常使用常规启动子，比如过表达使用CMV，干扰等短序列使用U6。

下表为AAV靶向肠道不同部位较优血清型和启动子的总结：

系统给药方式中，尾静脉注射能够感染全身大部分器官，腹腔注射可以感染腹腔肠道平滑肌、浆膜等部位。

局部给药则可以提升肠道组织特异性表达，因此研究人员开发了多种肠道局部感染AAV的方法，包括灌肠、肠壁内注射、肠系膜动脉（SMA）注射等，总结如表2。

3.1 灌肠

灌肠的操作步骤，以小鼠为例（详见图1），具体如下：

（一）准备工作

‌器材准备‌：准备好灌肠所需的器材，包括灌肠针（可以是特制的或自制的，如使用直径约1mm的软管）、注射器、液状石蜡油（用于润滑）、灌肠溶液（根据实验需求配置）、固定器（用于固定小鼠）等。

‌小鼠准备‌：选择健康、年龄相近且体重适中的小鼠进行实验。在实验前，轻柔按摩小鼠腹部，以促进排出结直肠内残余的粪便。

（二）操作细节

1) ‌固定小鼠‌：用单手固定或者将小鼠固定于自制的固定器中，使其头朝下、尾朝上倒立，这样有助于灌肠液更好地进入肠道。

2) ‌润滑并插入灌肠针‌：用液状石蜡油润滑灌肠针，以减少插入时的阻力和对小鼠肠道的刺激。将灌肠针轻轻插入小鼠的肛门，一般插入深度约为4-5厘米，具体深度可根据小鼠的体型和实验需求进行调整。在插入过程中，要保持动作轻柔，避免对小鼠造成伤害。

3) ‌注入AAV病毒液‌：通过灌肠针缓慢注入200μL AAV（推荐注射剂量至少0.5~1*10^11 VG/只）。注入时要保持一定的速度，避免过快或过慢导致灌肠液溢出或小鼠不适。同时，要注意观察小鼠的反应，如有异常应立即停止操作。

4) ‌保持体位‌：灌肠液注入后，保持小鼠倒立体位约1分钟，以防止AAV病毒液立即流出。然后缓慢退出灌肠针，并将小鼠继续保持倒立5分钟，以确保病毒液在肠道内充分分布。

（三）注意事项

1) ‌无菌操作‌：在整个灌肠过程中，要严格遵守无菌操作原则，避免污染样本和引起小鼠感染。

2) ‌轻柔操作‌：在固定小鼠、插入灌肠针和注入灌肠液等步骤中，要保持动作轻柔，避免对小鼠造成伤害或引起其强烈挣扎。

3) ‌适量灌肠‌：根据小鼠的体型和实验需求确定灌肠液的量和注入速度，避免过量或过快导致小鼠不适或灌肠液溢出。

‌伦理原则‌：在进行小鼠灌肠实验时，要遵循动物实验的伦理原则，确保实验过程对小鼠的福利和权益得到保障。

3.2 肠壁内注射

肠壁内注射主要用于感染肠神经系统的粘膜下丛（SMP）、肌间神经丛（MP）、胶质细胞（Glia）等。

由图2可知，血清型AAV1、2、5、6、8和9之间进行比较，成年雄性大鼠在降结肠壁直接多点注射AAV（5μL/点*6点，1.0*10^12 VG/mL），一个月后处死，此时在荧光显微镜下解剖和观察SMP。AAV6和AAV9的GFP阳性细胞数量明显多于AAV1和AAV2，更加适用于肠神经系统粘膜下丛（SMP）的感染。[2]

3.3 肠系膜动脉注射（SMA）

肠系膜动脉（SMA），主要分为肠系膜上动脉和肠系膜下动脉。根据小肠解剖结构来看（图4），肠系膜上动脉分布于小肠左侧，肠系膜下动脉分布于结肠、大肠及泄殖腔部位，因此通过该方法可以有效感染小肠及结肠组织。SMA注射对实验员的操作技术要求较高，对实验动物的伤害性也较大。

SMA的操作步骤，以小鼠为例（详见图4、图5），具体如下：

1) 将小鼠放入含有浓度为2-4.5%异氟醚氧气的诱导室中。一旦动物达到深度麻醉，就将其取出，放在带鼻锥的手术台上。在手术过程中，通过闭路系统吸入1.5-3%的异氟醚氧气来维持麻醉。通过关注动物的呼吸模式、活动以及对脚趾皮肤挤压反应来监测麻醉效果。

2) 将动物放置在手术板上，使其处于右侧卧位，四肢放松，同时进行手术麻醉。为了保持足够的体温，在手术板下方放置了一个加热垫。去除手术部位的毛发。使用2%氯己定和无菌生理盐水对手术部位进行擦洗。手术前，所有器械都经过高压灭菌处理。将一个带有粘性孔的小无菌盖布放在小鼠身上。整个手术在手术显微镜下进行，放大倍数为5-40X。

3) 到达手术麻醉平面后，皮下注射0.1mg/kg丁丙诺啡用于手术镇痛。将0.125%布比卡因溶液以2 mg/kg剂量注射到沿左腋线的最后一个骨内间隙和肋下区域进行局部镇痛。沿着腋线和侧腹，在脾脏区域上方的左侧皮肤上切开1-2 cm的切口。切开腹外斜肌，切口延伸长度不超过1-1.5 cm，以暴露SMA。使用微型牵开器将皮肤和腹壁固定在视野之外，并缩回小肠，用温盐水纱布覆盖，以暴露SMA（图5A）。

4) 在20倍放大镜下，轻轻地将SMA从腹膜后剥离。在SMA的近端取件周围放置一个小的稳定扎带，以固定注射针。使用微血管夹暂时阻断腹主动脉的血液供应（图5B）。

5) 将定制33号1/2针头连接到250μl汉密尔顿TLL气密性进样针注射器上，轻轻插入SMA进行病毒注射（100~200μL体积的AAV，推荐注射剂量0.5~1×10^11 VG/只）。将固定带轻扎血管，防止注射部位泄漏。全程使用手术显微镜对注射进行可视化追踪，以确保注射位置准确。（图5C）

6) 注射后，立即取出针头，使用10-0单丝尼龙缝合线单针缝合SMA中的注射部位。移除稳定带和微血管夹，使血液流回小肠（图5D）。

7) 使用无菌棉签对注射部位施加轻微压力以去除血液。伤口缝合前在腹腔内注射1mL无菌温盐水。使用连续缝合方式缝合腹部肌肉。使用连续或间断缝合方式缝合皮肤。

8) 术后每15分钟对动物进行一次监测，直至胸骨卧姿能够保持，然后在第一天每2小时监测一次，直至返回动物培养设施。每天监测一次动物的正常行为、饮食以及任何潜在的痛苦迹象。术后至少48小时，每8-12小时服用一次丁丙诺啡（0.1 mg/kg）以控制疼痛。手术后7-14天，在麻醉条件下取出缝合线，并仔细检查手术部位。

本文介绍的几种常用的肠道感染AAV的注射方法，根据文献和以往经验，使用灌肠感染肠道，推荐AAV1或AAV5；尾静脉注射、腹腔注射、肠壁内注射和肠系膜动脉注射更推荐使用AAV9。启动子使用常规CMV、U6启动子等。