吉玛AAV研究指南-骨骼篇_摩熵医药(原药融云)

吉玛AAV研究指南-骨骼篇

一．骨骼和AAV简介

骨骼是组成脊椎动物内骨骼的坚硬器官，功能是运动、支持和保护身体；制造红血球和白血球；储藏矿物质。骨骼由各种不同的形状组成，有复杂的内在和外在结构，使骨骼在减轻重量的同时能够保持坚硬。骨骼的成分之一是矿物质化的骨骼组织，其内部是坚硬的蜂巢状立体结构；其他组织还包括了骨髓、骨膜、神经、血管和软骨。

AAV是基因治疗领域最常用的基因递送的载体。例如，骨靶向rAAV9介导的基因治疗为探索低骨量下人类骨骼疾病的miRNA治疗提供了新的机会[1]。此外，AAV基因治疗的潜力不仅限于骨质疏松症，特别是罕见的骨骼疾病，AAV运送有效载荷纠正基因突变的能力提供了直接解决这些疾病背后的遗传缺陷的方法之一。

对于做骨骼方向的基础研究或者临床科研的研究者，他们最关心如何用AAV靶向骨骼系统实现目的细胞的特异性调控。本文将重点介绍骨骼系统的AAV靶向策略。

二、血清型和启动子推荐

2.1 血清型选择

骨骼系统里骨组织包含的细胞主要有四种：骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞以及破骨细胞。在Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis这篇文献[2]中，作者在体外检测了不同血清型AAV对成骨细胞（COB），骨髓间充质来源的成骨前体细胞（BM-OCP）和软骨前体细胞系（ATDC5）的感染效率，结果表明rAAV-1，4，5，6，7，9，rh10和rh39等八种血清型的AAV在体外成功感染成骨细胞。

图1. 体外转导骨细胞的rAAV不同血清型使用效果鉴定。a、b用PBS或14种不同的AAV血清型侵染成骨细胞（COB）、骨髓源性破骨细胞前体（BM-OCP）或软骨生成细胞（ATDC5）后，通过WB鉴定EGFP表达情况。

结果表明只有rAAV9可以成功感染松质骨和皮质骨处的骨骼细胞，包括骨细胞、成骨细胞和破骨细胞等。

2.2 启动子推荐

骨骼系统的研究中，可以使用常规启动子比如过表达使用CMV，干扰等短序列使用U6；此外，还可以选择相应的组织特异性启动子如下：

三．注射方法选择

对于骨骼系统的AAV靶向策略来说，骨骼系统的结构分为三种注射方式。一种是针对骨骼系统特异性的注射方式：骨关节腔注射；另一种是常规的静脉注射；还有一种是针对骨髓的骨内注射。

3.1 骨关节腔内注射：

上述的文献中，作者采用了膝关节注射AAV到两个月大的小鼠的膝关节内。注射的剂量都是1*10^11 GC/只，AAV滴度为1~6*10^12 GC/mL的范围内。

3.2 骨内注射：

在Adeno associated viral-mediated intraosseous labeling of bone marrow derived cells for CNS tracking这篇文献[3]中，作者采用了骨内注射的方式，滴度为4.5*10^13 VG/mL，注射体积为5μL，感染四个月的小鼠。对于骨内注射的具体的操作步骤如下：

1. 用异氟烷对小鼠进行麻醉，双膝屈曲，膝后各有一个支撑物。剃除关节周围的毛发，用 70% 的酒精和碘酒清洁关节区域。

2. 用1毫升注射器，将25号针头插入股骨内间隙，在胫骨和股骨关节之间的股骨顶部髁之间轻轻扭转并施压，将25号的针头和针帽留在原处，轻轻取出 1 毫升注射器。

3. 将带有32G针头的汉密尔顿注射器插入塑料盖开口。32G骨髓针在距针尖3.5厘米处做标记，以指示穿刺长度。

4. 将病毒缓慢注入股骨柄。然后慢慢取出以限制回流。轻轻拔出针头，观察小鼠让其恢复。

如图所示，用于骨内注射的骨内针为rAAV9-或慢病毒GFP的给药提供了一种有效的途径。图中采用解剖的小鼠股骨来进行可视化演示。由矩形和/或数字指示的区域在插图中被放大。将一根25号注射器针从远端穿过骨的硬皮质，插入软骨髓内部股骨的前部，再将带有33号针头的汉密尔顿注射器（cat # 7653, 10 μl）插入25号针头中，用于输送病毒。图中显示5μl蓝色染料填充股骨腔。[3]

3.3 静脉注射：

在Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis这篇文献[2]中，作者除了采用关节腔注射之外，还采用了静脉注射的方式。如上图所示，作者为了测试AAV9在体内系统递送时靶向骨组织的能力，将rAAV9-EGFP注射到2个月大的小鼠体内，并通过EGFP的表达评估 rAAV9 在组织中的分布。在这里作者采用的就是静脉注射的方式，剂量是4*10^11 GC，注射两周之后评估绿色荧光的分布能力。结果表明，EGFP主要在骨皮质和骨小梁中的骨内膜成骨细胞和骨细胞中表达，而在韧带、关节软骨和骨韧带中则没有表达。这些结果表明，系统递送的 rAAV9 向量靶向骨内的成骨细胞。

结合文献和经验，推荐客户针对骨骼系统的AAV感染策略上优先采用血清型AAV9；启动子可选常规启动子（CMV、U6）或组织特异性启动子Runx2（成骨）、Col2a（软骨）；注射方式推荐骨关节腔注射。AAV病毒滴度选择1*10^13 VG/mL, 注射体积5～10uL/关节。

四．参考文献

[1] John AA, Xie J, Yang YS, Kim JM, Lin C, Ma H, Gao G, Shim JH. AAV-mediated delivery of osteoblast/osteoclast-regulating miRNAs for osteoporosis therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 2022 Jul 11;29:296-311. doi: 10.1016/j.omtn.2022.07.008.

[2] Yang YS, Xie J, Wang D, Kim JM, Tai PWL, Gravallese E, Gao G, Shim JH. Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis. Nat Commun. 2019 Jul 4;10(1):2958. doi: 10.1038/s41467-019-10809-6.

[3] Selenica ML, Reid P, Pena G, Alvarez J, Hunt JB Jr, Nash KR, Morgan D, Gordon MN, Lee DC. Adeno associated viral-mediated intraosseous labeling of bone marrow derived cells for CNS tracking. J Immunol Methods. 2016 May;432:51-6. doi: 10.1016/j.jim.2016.01.008.