吉玛AAV研究指南-肺脏篇

腺相关病毒（AAV）是一种高效的基因疗法工具，被用于基因递送至各种体内组织。在许多已经表征了的AAV血清型中，每种都有独特的转导途径和基因表达动力学。AAV衣壳可以通过引入点突变进行工程改造或通过定向进化增强其作为基因治疗载体的效力。小鼠经常被用作临床前模型，以验证基因治疗载体的有效性；因此，将AAV有效递送至小鼠肺部至关重要。本文将详细介绍几种常见的AAV递送到肺部的方法。[1]

2.1 血清型选择

许多文献已报道AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV9等血清型均可以感染动物肺脏。如果选择AAV血清型嗜性、注射方式不同，AAV对于肺脏的感染效率及部位也会有所差异。如AAV9经气管注射主要感染肺泡上皮细胞，对于支气管上皮细胞的感染极少；AAV6及其突变体AAV6.2经气管注射可以高效转导支气管和肺泡上皮细胞，且在肺类器官中也表现出良好的感染效率，这几种AAV也是目前用于肺部研究使用较多的血清型。更详细的血清型的感染特征用户可以参考下表1。

在小鼠及一些较低等的灵长类动物中，AAV5及AAV6是感染肺部的理想选择；针对高等灵长类动物，AAV1对肺部的感染效率更高；在肺癌的研究中，我们通常推荐AAV2血清型。

Helena Meyer-Berg在2020年发表的研究表明，其所用多种AAV血清型中，rAAV2和rAAV6以及rAAV6变体（rAAV6.2和rAAV6.2FF），对人肺实质亲和性较强，如图1所示。[2]

2.2 启动子推荐

  肺脏的研究中，可以使用常规启动子比如过表达使用CMV，干扰等短序列使用U6；此外，还可以选择相应的组织特异性启动子如下表2：

对于肺部AAV感染，一般注射方法主要有系统注射和经呼吸道感染。常见方法有：尾静脉注射、滴鼻/鼻内滴注、气管插管术和气管内注射。

尾静脉注射虽然操作简单，但是AAV会同时感染其他脏器，主要在肝脏富集，使得靶向肺脏的病毒减少，因此需要考虑血清型的选择，经尾静脉注射可以实现肺脏内皮细胞的高效转导；滴鼻和气管内递送方法可以最大程度地实现靶向递送，并在肺部高效表达，同时降低病毒剂量。但气管内递送有一定的操作难度，有手术风险等缺点。（详见表3）

3.1 滴鼻/鼻内滴注：

1) 配制AAV滴注液，AAV滴度不低于1*10^12 VG/mL。

2) 用40μL/20g重量的氯胺酮/甲苯噻嗪溶液麻醉小鼠。确保每只老鼠都被完全麻醉，对脚趾挤压刺激没有反应。

3) 垂直握住小鼠，头部向后倾斜，用100μL移液器缓慢将35-40μL AAV病毒液（总量约1*10^11 VG）注入其中一个鼻孔。溶液应完全吸入肺部，不得经口吞食。使小鼠保持上述姿势约30~60s，以便AAV悬液充分进入下呼吸道。

4) 待小鼠在笼中恢复10min后，重复上述操作，再次给药35-40μL（每只小鼠共给药70-80μL）。

5) 将小鼠放回笼子里，监测它，直到它从麻醉中醒来。

3.2 气管插管术：

1) 麻醉后的小鼠通过其门牙放置在平台上，使其胸部垂直悬挂在其下方（a，b）。

2) 光线照射在小鼠的上胸部（a，c），标记为“X”（c）的位置。

3) 使用Exel Safelet IV导管（d）张开嘴，用平钳轻轻拔出舌头。

4) 在定位气管发出的白光（e）后，将Exel Safelet IV导管滑入气管（f），并拔出针头（g）。

5) 将平台上插入导管（h）的小鼠移入生物安全罩中，在那里病毒被分配到导管（i）的开口中。

3.3 气管内注射：

1) 采用异氟烷气体麻醉或者腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪将小鼠麻醉，使其进入无意识状态。

2) 准备40-80μL的AAV（总量约1~2*10^11 VG）病毒于29G 结核菌素注射器。

3) 将小鼠背部朝下从麻醉室转移到手术板上，并将小鼠鼻锥放在鼻子上进行麻醉。

4) 用胶带将小鼠伸展的前腿固定在手术板上。

5) 剃除颈部部分区域的鼠毛，制造一个洁净的手术区域。

6) 用碘伏做消毒处理。

7) 通过捏后脚来检查小鼠是否完全失去知觉。如果小鼠有反应，则需进一步麻醉。

8) 使用弯曲的镊子抓住前腿之间的颈部皮肤，并使用外科剪刀做一个5-7毫米小切口。

9) 可视化气管环，并使用非惯用手中的弯曲镊子轻轻固定气管。

10) 使用优势手握住注射器，使斜面朝上，与气管成45 度角，针头朝向尾部。以45 度角插入针头几毫米。

11) 将AAV缓慢注入气管。等待5 s后再缓慢取出针头。

12) 放置2-4个简单的缝线以闭合切口部位。

13) 将小鼠从鼻锥中取出，放在有加热灯的恢复笼中，直到完全清醒。