OMIP-105：30色光谱方案，全面分析小鼠脾脏和肿瘤中免疫细胞变化

第一步：将同源肿瘤异体移植MC-38结肠癌小鼠的脾脏和肿瘤解离消化，作者对单细胞悬液进行了精细的染色处理。在这套流式分析策略中，作者首先圈出所有CD45⁺免疫细胞，通过Live/Dead Blue染料、FSC（前向散射光）及SSC（侧向散射光）等多维度参数，剔除了死细胞及非单细胞事件的干扰。联合使用CD11b和NK1.1分别圈出CD11b⁺髓系细胞，NK1.1⁺NK细胞，和CD11b^-NK1.1^-双阴性细胞。

第二步：CD11b⁺髓系细胞中包含在肿瘤微环境中具有重要作用的CD11b⁺ F4/80⁺的肿瘤浸润巨噬细胞（TAM：tumor-associated macrophages）和经典的CD11b⁺F4/80^-MHC-II⁺CD11c⁺树突状细胞（cDCs）。CD11b⁺F4/80^-MHC-II^-的细胞则可进一步细分为Ly6G^-Ly6C^hi单核细胞（在某些情境下亦称单核性髓源抑制性细胞，M-MDSCs）和Ly6G⁺Ly6C^med中性粒细胞（亦称粒系髓源抑制性细胞，G-MDSCs）。

第三步：从第一步筛选出的CD11b^-NK1.1^-免疫细胞中，可以清晰地将其区分为两大类：MHC-II⁺CD19⁺的B细胞，以及CD19^-的非B细胞。进一步地，B细胞根据CD45R/B220的表达水平，被细化为CD45R/B220表达较低的B1细胞和CD45R/B220表达较高的B2细胞。

第四步： 联合使用CD3和CD11c，CD19^-的非B细胞群可以大体上分成CD3^-CD11c⁺树突状细胞和CD3⁺CD11c^+/-T细胞。树突状细胞又能够被圈出PDCA-1⁺CD45R/B220⁺浆细胞样树突状细胞（pDCs：plasmacytoid dendritic cells）和CD11c⁺MHC-II⁺CD11b^-经典树突状细胞（cDCs：conventional dendritic cells）。后者在T细胞激活和调控中占据重要地位。

第五步：基于TCRβ表达水平的差异，CD3⁺CD11c^+/-T细胞群体可细分为TCRβ⁺T细胞与TCRβ^-T细胞（即TCRγδ⁺T细胞）。在TCRβ⁺T细胞内，进一步包含两大功能迥异的亚群：CD8⁺细胞毒性T细胞，和 CD4⁺辅助性T细胞。尤为值得注意的是，CD4⁺T细胞中存在一个关键亚群——以CD25⁺Foxp3⁺为标志的调节性T细胞（Tregs），它们在维持免疫稳态、防止自身免疫反应中发挥着不可替代的调控作用。

第六步：通过引入颗粒酶B、Ki67、PD-1/PD-L1、Lag3、Tim-3及CTLA-4等标记物，能够更为精细地刻画T细胞的分化阶段与免疫功能特性。结果揭示，相较于脾脏环境，肿瘤微环境中CD8⁺T细胞群体中PD-1与Lag3双阳性细胞的比例显著上升，暗示肿瘤浸润的T细胞更倾向于呈现耗竭状态，即其功能受到显著抑制。另一方面，肿瘤微环境内的CD11b-cDCs（经典树突状细胞）与单核细胞显著上调了PD-L1的表达，这一现象反映了它们在调节抗肿瘤免疫反应中扮演了更为积极的角色，通过增强免疫抑制效应来调控局部免疫应答。