ITRs（反向末端重复序列）是生产rAAV载体所需的唯一顺式作用元件，它们位于AAV基因组的两侧，是AAV基因组自我复制的起点以及触发病毒包装的信号，在病毒的复制和包装过程中起关键作用。ITR区域的完整性对重组腺相关病毒(rAAV)的生产以及活性至关重要，缺失、突变的ITR可能导致AAV病毒产量及活性降低。本文从ITR序列结构，其在基因组复制及表达中的作用以及ITR突变、缺失对AAV的影响等方面介绍ITR基础知识，同时回顾了目前已上市AAV基因治疗产品的ITR设计。
AAV2 ITR是使用最广泛的，其可以与各种血清型兼容，ITR的Flip构型与3’端靠近的位置为B-B’回文结构，而Flop构型与3’端靠近的位置为C-C’回文结构。AAV基因组两端可以均为Flip构型的ITR，也可以均为Flop构型的ITR，或者一端为Flip构型的ITR，另一端为Flop构型的ITR。ITR的D序列在基因组的两端各出现一次，保持单链状态。ITR的A-A’部分包含末端分辨位点（trs）和Rep结合元件（RBE），trs作为复制的起始位点，Rep结合元件（RBE）是AAV Rep78和Rep68蛋白结合的位置，RBE由一个四核苷酸重复序列（5’-GNGC-3’）组成。ITR的T形结构顶点对应一个额外的RBE (RBE’)，它可以稳定Rep78和Rep68蛋白与ITR之间的结合。据报道，两端ITR都是145 bp或130 bp版本的GOI质粒在AAV病毒产量及生物活性方面相似，因此这两个版本均被称为野生型。ITR结构详见Figure1~3：
Figure1: AAV2 ITR (Flip, 145 nt)
Figure2: AAV2 ITR (Flop, 145 nt)
Figure3: Recombinant ITR (Flop, 130 nt)
在Rep78和Rep68的ATP依赖型DNA解旋酶活性作用下重塑A-A’区域，形成一个顶端为单链形式的末端分辨位点（trs）的茎环结构。在这种构型中，Rep78和Rep68的ATP依赖型链与位点特异性内切酶催化域在trs处引入一个切口，启动后续的复制、转录和表达。ITR在基因表达过程中的作用构象见下图Figure4：
Figure4: ITR role in Vector Transgene Expression
ITR最常见的突变是在其中一个ITR的B或C环中出现一个小的缺失，这些小缺失通常被认为不会有什么问题，因为发生突变的ITR在AAV复制过程中具有独特的自我修复能力，这可能是通过位于基因组另一端的完整ITR实现的。据报道，其中一个ITR中的B环、C环或B-C环缺失的AAV病毒与野生型（两端ITR完整）AAV病毒在生物活性方面没有明显差异；其中一个ITR中的A区域缺失的GOI质粒生产的AAV病毒与野生型（两端ITR完整）AAV病毒在生物活性方面也没有明显差异；D序列对基因组包装很重要，其中一个ITR中的D区域缺失的载体与野生型ITR相比，生物活性会有所降低。ITR缺失对AAV效力的影响见下图Figure5：
Figure5: Impact of ITR deletion on potency
有报道称，虽然145bp的wtAAV2 ITR质粒转化stbl3感受态后，~40%的克隆有出现ITR突变（主要为其中一端ITR的B环或C环缺失），但是在挑选出ITR完整的克隆后，在后继的扩增和发酵过程中没有再出现ITR突变。并且，目前已上市的8款AAV基因治疗产品中有5款是采用HEK293生产体系生产的，这5款产品中有3款产品（Luxturna\Upstaza\Elevidys)的载体两端ITR均使用了145bp的wtAAV2 ITR，其中1款产品（Zolgensma)的载体ITR为5'：106bp、3'：143bp，另1款产品（Beqvez)的ITR信息不明。可见，大部分HEK293生产体系生产的已上市AAV基因治疗产品选择了145bp的wtAAV2 ITR，说明145bp的wtAAV2 ITR在CMC开发及监管机构上市审评过程中得到了充分论证，可以确保药品安全、有效和质量可控。
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参考文献：
https://doi.org/10.1101/2024.06.17.596931;
https://doi.org/10.3390/ microorganisms12020310
浙公网安备33011002015279
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