最新成果揭示表观修饰调节白血病细胞生长的关键机制

10-11易位蛋白（ten-eleven-translocation protein，TET）家族负责调节催化产生DNA羟甲基化修饰，是一种DNA主动去甲基化的重要修饰，该家族包含包括TET1、TET2、TET3。DNA胞嘧啶（c）在DNA甲基转移酶（DNMT）的催化下形成5-甲基胞嘧啶（5mC），而TET家族通过氧化脱氨反应，将5mC脱氢加氧转变为5-羟甲基化胞嘧啶（5hmC），从而开始DNA的主动去甲基化过程。5hmC的分布具有组织或细胞特异性，并且在基因组上的增强子区域有选择性，但这种选择性分布的机制并不清楚。在多种癌细胞中经常观察到TET2的功能缺失，并且TET2在多种血液学恶性肿瘤中发现存在突变。

细胞内的分子由于多种弱相互作用而聚集在一起发生相变，产生的类似“液滴”的物质，成为生物分子凝聚体。在细胞内部，多种生物分子凝聚体通过液-液相分离作用之间产生联系，并且随细胞生命活动而变化。这篇文章揭示了TET2存在液态凝聚的特性，并且该特性是由TET2特殊的区域导致的，并在一定程度上解释了TET2在催化5hmC上的选择性的机制。

研究人员鉴定出TET2蛋白中存在低复杂度插入区（LCI），并且通过TET2融合GFP标签，TET2蛋白可在HEK293T形成点状分布（图1a），并且内源性的TET2蛋白也可在mESCs以及HSPCs中形成点状的分布（图1b）。

通过光漂白荧光恢复技术（FRAP）发现，TET2形成的点状分布是动态变化的（图1c、d）。通过计算预测得出TET2中存在6个无序区（IDRs）（图1e），而在OptoDroplet实验中发现其中一个无序区在光刺激后显示出明显的点分布（图1f），并且随时间恢复（图1g、h）。并且体外表达TET2也形成了液态凝聚的现象（图1i）。以上结果证明TET2可在体外或细胞内形成液-液相分离的特性。

图 1. TET2通过LCI结构域形成液态凝聚

由于LCI结构域有朊蛋白样的结构，富含极性氨基酸并分散分布芳香族残基，因此研究人员将LCI结构域的芳香族残基（Y和F）用丝氨酸（S）替代（Y,F→S），并且改变芳香族残基的分布，来达到均匀（LCI-perfect）或集中（LCI-patchy）的分布（图2a）。在OptoDroplet实验中发现，均匀分布的变体仍能形成液态聚集，但集中分布的变体则形成能力减弱（图2b）。而Y,F→S变体则不能形成液态聚集（图2c）。集中分布的变体形成的液滴不容易分散，在体外实验也是如此（图2d）。在FRAP实验中，均匀分布的变体恢复能力更强，而集中分布的变体则恢复时间延长（图2e）。

除芳香族残基外，研究人员又将所有的G替换为A（LCI-G→A），这个变体形成液态凝聚的能力正常，但FRAP实验中的恢复时间轻微延长（图2f）。以上结果证明TET2形成液态凝聚的特性依靠LCI的结构域，特别是LCI结构域中的芳香族残基。

图 2. TET2形成液态凝聚的分子机制

通过基于TurbioID-生物素标记的方法（图3a），研究人员探究了TET2催化结构域（TET2CD）以及缺乏LCI结构域的变体（TET2CDΔLCI）的富集蛋白，发现TET2CD存在147个蛋白，但是TET2CDΔLCI不存在富集蛋白（图b）。

由于UTX和MLL4被报道能够形成液态凝聚的现象并且会调节增强子上的组蛋白修饰，因此研究人员构建了CRY2融合UTX IDR的蛋白，并且发现TET2CD能够与融合蛋白形成共凝聚的现象，而TET2CDΔLCI则不能形成（图3c）。ChIP-seq的结果发现TET2CDΔLCI在增强子区域的富集减少（图3d）。

在利用前面构建的TET2的变体重复实验发现，只有TET2LCI和LCI-perfect变体能够与UTX和MLL4形成液态凝聚，并且LCI-G→A的变体能够自发凝聚（图3e-h）。体外实验也验证了这一现象（图3g, h）。以上结果说明TET2LCI结构域在形成液态凝聚的关键作用。

图 3 TET2通过LCI结构域与增强子调节因子形成液态凝聚

研究人员通过DamID检测了TET2CD以及TET2CDΔLCI的定位（图4a），并于已发表数据相比，分析了该方法的准确性，且TET2-Dam信号与H3K27ac信号有正相关关系（图4b）。在表达TET2CDΔLCI-Dam的细胞中发现，Dam信号显著减少（图4c, d），这与WB结果显示的染色质减少吻合（图4e）。

与TET2CD-Dam相比，TET2CDΔLCI-Dam的基因组分布向基因间区转移，并且在启动子和基因编码区富集程度较高（图4f）。TET2CD-Dam组TET2在富含H3K27ac标记的增强子区域有强烈的富集，但TET2CDΔLCI-Dam组该处没有富集（图4g）。

通过比较TET2CD、TET2CDΔLCI与TET1/2/3三敲的细胞的DNA甲基化变化，研究人员在TET2CD和TET2CDΔLCI组鉴定了hypo-DMRs区域（图4h），在这些区域内，91% 的TET2CD相关的区域与TET2CDΔLCI相关区域有重叠（图4i, j），但有72%的TET2CDΔLCI相关区域与TET2CD相关区域无关（图4i-k）。虽然TET2CDΔLCI-Dam组Dam信号降低，但是在基因组上出现了新的与TET2CD区域不同的信号（图4d），这些信号的分布更广，并且这些区域的DNA甲基化程度更低（图4l），说明TET2CDΔLCI变体与基因组结合的程度发生了变化，但催化程度没有明显变化。

以上结果表明，TET2中LCI结构域的缺失不影响催化活性，但是会影响染色质的特异性结合（图4m），导致全基因组非特异性的DNA去甲基化。

图 4  LCI结构域参与TET2的精准DNA去甲基化过程

在肿瘤细胞内诱导表达TET2CD和TET2CDΔLCI蛋白后，表达TET2CDΔLCI蛋白的细胞会表现出细胞增殖的下降以及细胞凋亡的增加（图5a, b）。在诱导表达前面构建的TET2LCI变体后，TET2CD-Y， F→S变体表现出抑制白血病细胞生长的作用（图5a）。

研究人员采用雷帕霉素诱导来招募FKBP（C-BLOCK）形成HOOK（FRB）二聚体从而扰乱液态凝聚的形成过程（图5c）。在雷帕霉素处理后，实验组凝聚的现象显著减弱（图5d）。与对照相比，MOLM-13细胞与THP-1细胞在表达TET2CD-FRB后5hmC的水平有所提升（图5e），细胞增值下降、细胞凋亡增加（图5f）。在使用MOLM-13荷瘤实验中，表达TET2CD-FRB经雷帕霉素诱导后肿瘤细胞数量下降，证明扰乱TET2的凝聚过程会抑制白血病细胞的生长（图5g-i）。

图 5 扰乱TET2的凝聚抑制白血病的进程

研究人员在小鼠上敲除了TET2LCI结构域（图6a, b），在HSPCs中TET2LCI缺失导致5hmC的增加（图6c）。将野生型、TET2CDΔLCI或TET2-KO小鼠的HSPCs与CD45.1小鼠分离的HSPCs以1:1的比例混合，进行体外竞争性集落形成实验和体内骨髓移植实验发现（图6d），TET2-KO HSPCs优于CD45.1 HSPCs（图6e-g），但与野生型相比，TET2CDΔLCI HSPCs没有差异，表明TET2中LCI结构域对造血的影响很小（图6e-g）。

随后研究人员将MLL-AF9的基因转入上述细胞内，并将细胞移植到受辐射的CD45.1+小鼠中（图6h）。与野生型相比，TET2CDΔLCI+MLL-AF9 HSPCs的存活时间更长，而TET2-KO+ MLL-AF9 HSPCs 则肿瘤进展加快（图6i）。移植21天后，TET2CDΔLCI+MLL-AF9小鼠脾脏大小正常，外周血和骨髓中MLL-AF9细胞比例最低，但TET2-KO+MLL-AF9组脾脏明显增大，MLL-AF9细胞数量增加（图6j, k）。以上结果说明LCI结构域缺失干扰TET2正常凝聚，从而对白血病细胞的增值有抑制作用。

图 6 扰乱内源性TET2凝聚影响白血病细胞的增值

研究人员采用CMS-IP-seq的方法检测5hmC的分布（图7a），并发现TET2CD峰的数量要大于TET2CDΔLCI（图7b），但是TET2CDΔLCI中5hmC的量要比TET2CD的多（图6d）。在对识别的5hmC的峰归一化计算发现，表达TET2CDΔLCI的细胞在5hmC的峰附近存在比TET2CD更强的信号，并且随时间推移信号越强（图7c）。而WGBS分析发现，TET2CDΔLCI的MOLM-13细胞存在全基因组的DNA甲基化确实（图7d），说明TETLCI结构域的缺失将导致整个基因组的非特异性的DNA去甲基化。

在Micro-C实验中，TET2CDΔLCI组中DNA甲基化降低的基因转移到了染色质隔间Compartment B中（图7e, f）。并且分析发现TET2CDΔLCI组大部分差异表达基因都与A到B的转移有关（图7g），这种转移与程序性细胞死亡、应激反应与细胞分化相关（图7h）。在对差异基因评估后确定了15个预测生存相关的基因，并用TCGA数据分析发现，根据这15个基因进行评分，高风险患者的生存率明显较短（图7i），这意味着这15个基因对AML患者治疗存在潜在价值。

图7 TET2凝聚的缺失导致染色质拓扑异构结构的改变

该文章首次揭示了TET2形成液态凝聚的关键结构域，并且证明了LCI结构域在选择性DNA去甲基化功能、染色质结合、3D结构改变的重要性，也研究了在抑制白血病进程方面存在作用，为疾病治疗提供了一种新的可能。

但值得注意的是，这种作用与液-液相分离的模型有所不同，TET2的这种液态凝聚的特性是由于IDR区域导致的，因此需要更深入的探究以阐明TET2是否存在液-液相分离的可能性。另外由于TET家族存在多种变体，该实验结果仅针对TET家族中的TET2蛋白，而家族中其他蛋白是否有这种特性，也需要更深入的解释。

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