提高AAV产率新策略，增强ER蛋白加工基因表达可使AAV产量提高100%

重组腺相关病毒（rAAV）载体是基因治疗中最具有前景的病毒载体之一，目前，基于人胚胎肾293（HEK293）细胞的三质粒转染是最常用的rAAV载体生产系统，但其较低的生产效率成了rAAV基因治疗药物商业化道路上面临的挑战之一。鉴于这一挑战，研究人员正在致力于开发其改进方法来提高rAAV在HEK293细胞中的产量。

有研究显示，HEK293细胞在进行rAAV等病毒载体生产时，表现出包括内质网（ER）应激在内的一些列反应，ER应激会激活下游的未折叠蛋白响应（UPR），以减轻宿主细胞的压力，确保细胞存活并生产病毒载体。根据转录组学数据，研究人员发现内质网应激上调时，以下三个基因表达显著增强：GADD34/PPP1R15A、热休克蛋白家族成员6（HSPA6）和X-框结合蛋白1（XBP1）。这些基因被认为在病毒生成过程中发挥了较为重要的作用。GADD34在未折叠蛋白响应信号暂时抑制翻译后恢复蛋白质合成的过程中起着关键作用；HSPA6是一个由UPR信号通过活化转录因子6（ATF6）调控的内质网伴侣蛋白，其表达可以促进内质网蛋白质的转运、折叠、分泌及错误折叠蛋白质的降解；XBP1的激活也可以促进内质网蛋白质的转运、折叠和分泌。据此，研究人员假设，这些蛋白质加工基因的过表达可以减轻因病毒蛋白质合成引起的宿主细胞应激，减少错误或未折叠蛋白质的积累，并且增强病毒的生产。此外，有研究显示，抗凋亡基因BCL2的过表达能提高HEK293细胞中慢病毒载体的产量达53%。上述这些证明了ER蛋白质加工和抗凋亡途径在病毒载体生产中的重要作用。

为了提高rAAV载体产量，研究人员选定了上述四个候选基因：XBP1、GADD34/PPP1R15A、HSPA6 和 BCL2，并将这些基因稳定整合到HEK293宿主细胞系的安全港位点（即AAVS1位点）实现其过表达。使用传统的三质粒瞬时转染方法来评估rAAV载体的产量和质量。

结果显示，在病毒载体高产条件下，HEK293T细胞过表达XBP1、GADD34、HSPA6和BCL2后，rAAV2载体基因组滴度和包装效率有所提高。其中，rAAV生产量最高提高了100%，rAAV载体全衣壳比率最高提高了37%。而在其低产条件下，上述任何候选基因的过表达不会提高rAAV载体产量和质量。研究推测，在高产条件下，更多的蛋白质合成会导致更多的病毒蛋白在ER中积累，从而增加ER应激。ER蛋白加工基因的过表达在适应性UPR路径中发挥更重要的作用，有助于缓解ER应激，进而改善蛋白质折叠以备载体包装。此外，过表达组的细胞生长低于阴性对照组，但观察到了显著的生产率提升（约一倍），稳定整合这些ER蛋白加工基因后，稳转基因的持续表达会消耗营养和能量，减缓总体细胞生长。同时，增强的病毒包装过程消耗额外的营养与能量，这可能是细胞生长表现不佳的原因。

研究还指出，ER蛋白加工基因的过表达对提高rAAV的生产具有重要意义，未来，通过ER加工基因的各种过表达组合可能会更好地提高病毒载体生产率和整体产品质量。本研究中所观察到的病毒载体基因组滴度的提高得益于细胞内蛋白质生成的改善、病毒载体衣壳质量和病毒载体包装效率的提高。此外，这一生产能力的提高在不同的HEK293细胞系和各种AAV血清型（AAV2和8）中得到了验证，尽管其提高的程度略有不同。

这些发现进一步验证了从组学研究中识别出的分子层面的数据特征的价值，并表明细胞系改造工程可以作为一种有希望的策略来增强包括rAAV在内的病毒载体产量和质量。

E.N.D