项目文章|INT J SURG：血清细胞外囊泡4D-DIA蛋白组学揭示结直肠癌无创诊断的新型膜蛋白组学特征

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的恶性肿瘤，其发病率与死亡率在不同类型的肿瘤中均高居第三。由于缺乏早期诊断的有效方法，CRC患者的5年生存率约为50%至60%，而发生转移的患者仅为14％左右。若能对CRC患者进行早期诊治，其5年生存率可达90%。近年来，由于具有非侵入性和成本效益高等优点，液体活检技术被广泛研究并应用于临床。其中，针对体液中的外泌体进行检测分析，在癌症的诊断、治疗和预后预测过程中展现了巨大的临床应用潜力。中山大学附属第七医院尹浩帆团队近期在《International Journal of Surgery》（IF = 15.3）发表了研究成果，题为《Identification and validation of the surface proteins FIBG, PDGF-β, and TGF-β on serum extracellular vesicles for non-invasive detection of colorectal cancer: experimental study》。该研究通过4D-DIA蛋白质组学技术，分析了来自37例CRC患者和正常对照血清样本中的EVs，初步筛选出CRC与健康对照（HC）之间差异表达的膜蛋白标志物。随后结合EVs膜蛋白数据库及相关文献，选定10种候选膜蛋白在404例的扩展队列中进行CRC-EVArray芯片的检测。最终基于机器学习算法，研究团队开发了诊断性能优越的CRC-EVArray诊断模型。

1.4D-DIA蛋白质组学分析：研究团队首先从25例CRC患者和12例正常对照的血清样本中分离出EVs，并通过4D-DIA蛋白质组学进行检测分析，筛选出166个差异表达的蛋白质（DEPs）。通过结合EVs膜蛋白数据库和文献报道，研究团队最终选择了7种候选的EVs膜蛋白标志物：ANXA2、SRC、ANXA1、PDGF-β、FIBG、ENOA和TGF-β1。

2.大规模样本验证：研究团队进一步通过外泌体膜蛋白芯片EVArray对7种候选膜蛋白进行验证。结果显示，FIBG、PDGF-β和TGF-β在CRC组中显著升高，与蛋白质组学结果一致，而其它7种候选差异膜蛋白在两组间无明显差异。在大规模样本的训练集（n=214）和验证集（n=140）中，FIBG、PDGF-β和TGF-β 在CRC患者中的异常表达得到了进一步验证。此外，通过免疫胶体金电镜检测，研究还证实了FIBG、PDGF-β和TGF-β蛋白定位于EVs表面。

3. 机器学习诊断模型的构建与验证：基于FIBG、PDGF-β和TGF-β，研究团队构建并评估了一系列机器学习诊断模型。其中，神经网络（NNET）模型的表现最佳。在基于NNET算法构建的诊断模型中，FIBG、PDGF-β和TGF-β显示出较高的AUC值（分别为0.743、0.786和0.796），且均优于传统肿瘤标志物CEA和CA19-9（AUC：0.662和0.636）。在不同建模变量组合的NNET模型中，根据诊断表现最终筛选出了最优建模变量组合为FIBG、PDGF-β、TGF-β和CEA。研究团队将该组合对应的机器学习模型命名为CRC-EVArray诊断模型，其在训练集和验证集中均具有优秀的诊断表现（AUC：0.882和0.937）。

4.晚期腺瘤（AA）和HC的鉴别诊断：研究进一步通过CRC-EVArray平台检测了AA患者中血清EVs膜蛋白FIBG、PDGF-β和TGF-β的表达，并与HC组中的结果进行差异分析。结果显示，相比于HC组，AA患者中三种EVs膜蛋白水平显著升高。进一步评估CRC-EVArray模型对AA和HC的鉴别诊断能力，结果显示，在训练集和测试集中，CRC-EVArray模型对于区分AA和HC均具有较好的诊断效能。综上，CRC-EVArray模型作为一种新型临床辅助诊断工具，在CRC和AA患者的早期诊断上具有广阔的临床应用前景。

本研究结合了4D-DIA蛋白质组学与EVArray技术，筛选鉴定了CRC患者血清来源EVs膜蛋白的差异表达特征，并利用高通量的CRC-EVArray芯片进一步验证了三种EVs膜蛋白（FIBG、PDGF-β和TGF-β）的差异水平和诊断价值。基于机器学习算法，研究团队建立了EVs膜蛋白特征相关的CRC-EVArray诊断模型，显示出优越的CRC和AA患者早期诊断的预测效能，为CRC的无创诊断提供了具有临床应用潜力的新型临床工具。

中山大学附属第七医院尹浩帆老师为本文的通讯作者，黄智坚老师为本文的第一作者。