基础医学研究所刘德培团队报道模块化单链DNA donor实现效率高达90.03%的精确基因编辑

近日，中国医学科学院基础医学研究所刘德培团队在Nature Communications《自然·通讯》发表了“Enhancing homology-directed repair efficiency with HDR-boosting modular ssDNA donor”（模块化单链DNA供体提高同源定向修复效率）的论文。研究报道了在传统单链DNA供体（ssDNA donor）的5'端连接同源定向修复（homology-directed repair, HDR）增强模块，可实现内源基因位点的高效的精确编辑。

精确的基因编辑技术在生命科学研究及临床基因治疗领域扮演着至关重要的角色。以外源DNA donor介导的HDR途径，是实现精准基因编辑的一种极具潜力的手段。该方法因其分子量较小，且具有引入点突变、精确插入、精确删除以及整合大片段DNA的能力而备受关注。相较于双链DNA donor，单链DNA donor通常展现出更高的HDR效率和更低的细胞毒性。目前，提高单链DNA donor效率的最有效且可靠策略，是将单链DNA donor与Cas9核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）复合物结合，例如Cas9-avidin生物素ssDNA系统、RNPD系统、Cas9-PCV系统等。这些策略表明，单链DNA donor与靶位点的距离是影响HDR效率的关键因素。然而，这些方法依赖于对Cas9 RNP和/或单链DNA donor的化学修饰，存在诸多不足，如不适用于mRNA脂质纳米颗粒和病毒递送系统、与其他可编程核酸酶不兼容、可能降低Cas9活性以及增加生产成本等。这些局限性凸显了开发无需化学修饰的提高单链DNA donor效率方法的重要性。

图1.功能序列模块增强单链DNA donor的效力

在这项最新报道的研究中，研究人员提出了一个创新概念：通过结合偏好序列，将单链DNA donor与内源双链损伤断裂（double-strand break, DSB）修复相关蛋白连接，从而促进单链DNA donor向DSB位点的招募（图1）。研究首先通过寡聚脱氧核苷酸免疫共沉淀（ODN immunoprecipitation, ODIP）-Seq实验，揭示了内源DSB修复相关蛋白（如RAD51）具有序列偏好的ODN结合活性。在单链DNA donor的5'末端添加RAD51高亲和序列（即HDR增强模块）后，可显著增强其与RAD51的结合活性，进而提高Cas9/nCas9/Cas12a等系统在不同基因组位点和细胞类型中的HDR效率。结合DNA-PKcs抑制剂M3814或HDRobust策略，该模块化单链DNA donor实现了高达90.03%的HDR效率（图2）。

图2.HDRobust或M3814提高模块化单链DNA donor的效率

由于这些模块仅是单链DNA donor的5'端的附加天然DNA序列，且结合的是内源蛋白而非可编程核酸酶，因此这一非化学修饰依赖的策略成为目前最简便、安全、适用范围广的方法。基于其高效的基因编辑能力，科研人员有望在原位基因组中直接引入点突变，极大地简化并颠覆了基础医学研究中探索基因功能的方式。同时，模块化概念为开发多功能单链DNA donor，用于精确基因编辑和临床转化应用，开辟了一条充满希望的新途径。

本研究工作得到中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2021-I2M-1-016、2022-I2M-2-001和2023-I2M-2-005）等项目的资助。基础医学研究所刘德培院士和陈厚早教授为论文共同通讯作者，博士生金莹莹和助理研究员张鹏为论文的共同第一作者。

E.N.D