实体瘤腹膜转移在肿瘤治疗中带来了重大的临床挑战。腹膜肿瘤通常会形成针对免疫系统的逃避机制，导致疾病进一步的不利进展。探索针对大多数腹膜转移患者的替代免疫疗法在临床上是一个紧迫且尚未满足的临床需求。腹膜转移患者的腹膜腹水含有大量的免疫细胞，其中巨噬细胞约占45%。在肿瘤微环境（TME）中，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）大致分为促炎性M1或促肿瘤M2型，最高占总细胞的50%。在临床试验中，高水平的M2型TAM浸润通常与预后不良和免疫耐受有关。因此，改变巨噬细胞表型或功能可以开发增强对实体瘤免疫反应的方法。
嵌合抗原受体工程化巨噬细胞（CAR-Ms）对靶细胞表现出明显的吞噬活性，并且很容易穿透实体瘤，在临床前实体瘤模型中显示出肿瘤负荷降低和总生存期延长的显著疗效。然而，CAR-M疗法同样面临与FDA批准的CAR-T疗法相似的问题。复杂且昂贵的制造过程以及病毒载体细胞工程的安全性问题限制了CAR-M疗法的可及性。因此，基于非病毒载体递送的体内原位CAR-M疗法成为了有潜力的治疗方法。
2024年7月30日，中国科学院杭州医学研究所谭蔚泓院士、谢斯滔研究员和刘湘圣研究员等在预印本bioRxiv上预上传了题为“Intraperitoneal programming of tailored CAR macrophages via mRNA-LNP to boost cancer immunotherapy”的研究论文[1]。研究团队探索了36种含有不同巨噬细胞胞内结构域（ICD）的CAR组合，通过开发巨噬细胞靶向的mRNA-LNP递送系统，实现了高效的体内原位CAR-M构建。在免疫耐受实体瘤小鼠模型中，CAR-M的腹膜内编程与抗PD-1/L1免疫检查点抑制剂（ICB）疗法协同引发了强大的适应性免疫系统激活。
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CAR mRNA-LNP的设计
LNP设计
在LNP设计上，研究团队在原有4组分基础上掺入了具有巨噬细胞靶向特性的磷脂酰丝氨酸（PS），并用β-谷甾醇替代了胆固醇组分，制备得到了具有巨噬细胞靶向性的磷脂酰丝氨酸/β-谷甾醇LNP（“PSβ-LNP”）（图1a）。早前一项研究表明，含有合成磷脂酰丝氨酸的LNP可将mRNA更有效地递送至脾脏。亚器官分析显示，基于PS的LNP能够被红髓和脾脏边缘区域的组织驻留巨噬细胞广泛吸收[2]。此外，β-谷甾醇取代原始配方胆固醇虽然会降低LNPs的包封效率并使LNP尺寸增加，但其在多种细胞中的转染效率得到了显著提高。
CAR筛选
针对巨噬细胞量身定制的信号转导ICDs分别为介导吞噬作用的CD3ζ和Dectin1，促炎作用CD40和TLR4以及可能的效应子CD46和CFS2R。使用PSβ-LNP包封相应CAR mRNA转染骨髓源性巨噬细胞（BMDM）产生CAR-M（图1b）。随后，将巨噬细胞和表达荧光素酶的肿瘤细胞共培养和分析（图1d）。其中，PSβ-LNP的平均直径为164 ± 0.7 nm，多分散指数（PDI）小于0.1，pKa约为6.72，在细胞水平上表现出可控的粒径分布和出色的内体逃逸能力。
图1. 具有不同ICD的CAR mRNA-LNP设计
研究显示，Dectin1 CAR-M以类似于CD3ζ CAR-M的E:T（效应细胞：靶细胞）比率依赖性方式根除肿瘤细胞（图1e），进一步表明其吞噬活性不依赖于编码CAR的mRNA量。流式细胞术显示，CD3ζ或Dectin1 CAR-Ms与肿瘤细胞之间的相互作用更为重要，其对应的变化比例分别为20.5%或17.4%，而未处理（UTD）组仅为7.0%（图1f）。
此外，CD40或TLR4 CAR-M处理组的上清液中促炎细胞因子（包括 IL-6、IL-12和TNF-α）显著升高（图1h,i），仅在该两组种观察到IL-12基因表达的上调。CD46和CSF2R CAR组与UTD或空LNP组相比，均没有观察到显著差异，表明没有介导更多可辩别的功能（图1j,k）。
这些结果表明，CD3ζ或Dectin1 CARs可以介导巨噬细胞增强的吞噬功能，而CD40或TLR4 CARs诱导更显著的促炎调节。
因此，本研究中的CAR由抗原结合结构域（来自曲妥珠单抗的scFv或突变的Sirpα）、CD8α铰链、跨膜结构域和来自CD3ζ、CD40、CD46、CSF2R、Dectin1和 TLR4的细胞内结构域组成。
用T7启动子、5'-UTR和3'-UTR、CAR序列和poly(A)尾构建响应密码子优化的CAR质粒。通过限制性核酸内切酶BspQI进行线性化后，将纯化的DNA用作模板，通过T7 High Yield RNA Transcription Kit（Novoprotein）转录CAR-mRNA。
整个mRNA序列中的所有尿苷都被修饰的核碱基N1-甲基假尿苷（m1ψ）取代。用Cap 1 Capping System Kit（Novoprotein）加帽的IVT mRNA纯化并稀释至1 μg/μL备用。
ICD和ECD优化
考虑到mRNA编码CAR的时间限制以及靶抗原识别后CAR结构的潜在降解或丢失，受CAR-T疗法的启发，研究团队在ICD中引入了赖氨酸-精氨酸（K-R）突变（图2a），从而延长CAR的循环时间。研究表明，CARK-R与CARK在肿瘤靶细胞条件下表现出相似的代谢特征，但CARK-R的阳性率在每个时间点上都更高（图2b,c）。
在胞外结构域（ECD）的优化上，由于CD47和HER2的协调转录调控和表达，以及CD47-Sirpα轴在抑制巨噬细胞吞噬作用中的关键作用，团队设计了突变的Sirpα作为CAR构建体的高亲和力CD47抗原识别结构域，以破坏CD47-Sirpα相互作用，释放巨噬细胞细胞毒性（图2a）。
当E:T比为10:1时，αCD47 CAR显著增强了CAR-M吞噬作用，几乎根除所有肿瘤细胞，而αHER2 CAR-M组约有25%的肿瘤细胞保持存活（图2d）。以CD47和HER2阳性或阴性肿瘤细胞为靶点，证实通过CD47或HER2刺激可能触发吞噬细胞激活（图2e-g ），表现出长达72小时的连续和特异性吞噬过程（图2h,i）。
图2. CAR优化
mRNA PSβ-LNP腹膜原位CAR-M编程
研究团队构建了GFP-mRNA PSβ-LNP并对具有腹膜转移的结肠癌CT26同基因小鼠模型进行腹膜内注射，验证药物对巨噬细胞的核酸递送能力。在恶性腹水中，在PSβ-LNP组中检测到超过25%的GFP和F4/80（巨噬细胞表面标记物）双阳性细胞，显示约60%的F4/80阳性细胞在单次给药18小时内可成功转染，大大超过传统LNPs观察到的效率（图3b,c），在胰腺癌PAN02同基因小鼠模型中也观察到类似的结果。
此外，与对照组相比，观察到空LNP治疗组或mRNA-LNP处理组的腹膜液含有更高的总细胞计数（4000~6500万 vs. 2000万），巨噬细胞的比例从37.8%增加到45.6%或54.6%（图3b）。在恶性肿瘤中，大约23%的瘤内F4/80阳性细胞被转染，总共有3/4的转染细胞为F4/80阳性（图3d），表明PSβ-LNP对巨噬细胞具有出色的选择性和转染能力。
进一步的免疫荧光（IF）切片显示，广泛的eGFP表达主要出现在肿瘤内的巨噬细胞中，荧光从外围到内部逐渐加强（图3e）。此外，DIR标记的PSβ-LNP主要在腹膜内注射后积聚在肿瘤肿块上，很少分散出腹膜腔去往肝脏（图3f），表明PSβ-LNP在器官水平上的优异选择性。在卵巢癌SKOV3异种移植小鼠模型中也观察到了类似的结果。
图3. 腹膜给药巨噬细胞编程
在此基础上，研究团队进一步实验了PSβ-LNP CAR-mRNA在CT26-luc同基因小鼠模型中的抗肿瘤能力（图3g）。结果显示，CD3ζ CAR-M和Dectin1 CAR-M均具有有效的肿瘤抑制作用，显著延长了荷瘤小鼠的存活时间（图3h,i）。其中，与Dectin1 CAR相比，CD3ζ CAR表现出更优越的治疗效果，而在空LNP组中没有观察到显著治疗效果。此外，在干预前使用氯膦酸脂质体预先耗尽小鼠巨噬细胞，消除了随后的CAR-mRNA PSβ-LNP给药的治疗益处（图3j-l），强调了腹膜内巨噬细胞群体在体内使用CAR-mRNA PSβ-LNP进行CAR-M编程中的重要作用。
综上所述，研究全面验证了PSβ-LNP的体内巨噬细胞靶向能力和高效的mRNA递送能力，以及CAR-mRNA LNP的初步、长效抗肿瘤功效。
原位CAR-M治疗对免疫激活的影响
在CAR-M治疗后完全根除肿瘤的小鼠中再次皮下注射100万个肿瘤细胞（图4a）。长期观察结果显示，这些肿瘤细胞增殖再次被完全抑制（图4a,b），证实小鼠在治疗后成功获得全面、长效的适应性免疫保护。
与naive小鼠相比，治愈小鼠的肿瘤特异性T细胞数量显著增加，每1.5×105个脾脏细胞检测到1,118（vs. 253）个肿瘤特异性T细胞（图4c），表明CAR-M干预增强了抗原特异性T细胞的增殖。此外，将治愈小鼠1000万个脾细胞过继转移到naive小鼠体内同样抑制了肿瘤生长，但仅显示出边际肿瘤抑制（图4e），可能归因于肿瘤特异性T细胞的肿瘤浸润能力受限（图4f）。
图4. 原位CAR-Ms激活适应性免疫系统
在更晚期肿瘤小鼠模型中，进一步研究了促炎CAR（CD40和TLR4 CAR）与吞噬促进CAR的结合效应。研究发现，CD3ζ CAR、TLR4 CAR及其组合构建体都表现出更显著的肿瘤抑制作用（图4g）。值得注意的是，用TLR4 CAR或组合序列处理的小鼠腹膜液显示1型辅助性T细胞（Th1）和活性CD8 T细胞显著增加（图4h,i），表明组合CARs有效激活了适应性免疫系统。
此外，在组合CAR治疗的肿瘤中观察到最高的M1型巨噬细胞比率（图4j,k），表明组合CAR细胞促进了M1表型的维持。对细胞外细胞因子释放水平评估表明，在所有含有TLR4 CAR的组合中，促炎细胞因子释放水平更高。最重要的是，与CD3ζ/CD40 CARs相比，CD3ζ/TLR4 CARs在体外表现出更优越的肿瘤吞噬能力。
联合ICB疗法的协同作用机制
一般而言，CT26小鼠同基因肿瘤模型通常被认为对PD-1抗体不敏感。然而，PD-1抗体与CAR-M联合在晚期CT26腹膜内肿瘤中显示出轻微的抗肿瘤生长作用（图5a,b）。令人惊讶的是，这种组合在短暂的给药期间几乎完全根除了肿瘤细胞，并提高了小鼠的存活率（图5a-c）。
为了获得足够的肿瘤组织进行后续分析，将给药开始推迟到肿瘤接种后第12天，干预措施显示出与先前观察到的趋势一致的趋势。在CAR-M治疗组中，肿瘤中M1表型的比例最高（图5d）。相比之下，联合治疗组的T细胞浸润，尤其是CD8 T细胞显著增加（图5e）。同时，在CAR-M和联合治疗组的血液中检测到更高水平的IL-12（图5f），表明系统环境有利于激活多种免疫细胞，特别是细胞毒性T细胞。在未治疗组中，肿瘤核心和外围的免疫细胞数量显著降低。在αPD-1组中，观察到髓系细胞浸润增加。CAR-M和联合治疗组在肿瘤边缘和内部组织中均表现出多样化的免疫细胞存在。
此外，观察到集落细胞因子CCL1、CCL11、CXCL10、CXCL11和IFN-γ的上调，显著诱导TME内的单核细胞/巨噬细胞和T细胞的趋化性。
总之，CAR-M重塑了TME的细胞集落和细胞因子环境，促进了大量的免疫激活以支持T细胞功能。在复发型胰腺癌模型中，CAR-M与PD-1抗体联合使用的协同作用仍然使得肿瘤复发延迟和总生存期的延长（图5i,j）。
图5. 原位CAR-M与αPD-1的协同治疗
单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析结果显示，与αPD-1单一疗法或UTD相比，CAR-M和联合治疗组的T细胞和粒细胞增加，同时巨噬细胞群减少。巨噬细胞簇1表现为最高的抗肿瘤M1表型和最低的M2表型比例，在CAR-M和联合治疗组中所占比例最高（图6a-c），表明CAR-M有效维持了体内巨噬细胞的抗肿瘤表型。
事实上，研究表明，高达75%的肿瘤PD-L1可能来自巨噬细胞。与其他簇相比，巨噬细胞簇1表现出PD-L1基因（CD274）的显著上调（图6h），这一发现与体外观察到的CAR传导后巨噬细胞中PD-L1表达增加的结果一致（图6i-k）。同时， 巨噬细胞中的MHC I分子和MHC I相关基因表达显著上调。相比之下，肿瘤细胞中PD-L1的上调几乎是巨噬细胞中上调的10倍，MHC I仅显示轻微变化，表明肿瘤细胞对外部干预的负免疫调节反应明显升高（图6i,j,l）。
因此，研究团队采用siRNA对巨噬细胞中的PD-L1进行敲低。结果表明，siRNA介导的PD-L1敲低可以与同时进行的CAR-M疗法有协同治疗作用（图6m）。
图6. 原位CAR-M促进M1极化，PD-L1和MHC I表达增强
肿瘤内的所有T细胞群都表现出耗竭标志物TOX和PDCD1的显著上调（图6n）。PD-1抗体单药治疗组含有更高比例的效应T细胞。相比之下，CAR-M和联合治疗组富集了终末耗竭T细胞、增殖T细胞和前体耗竭T细胞（Tpex）（图6o），体现了CAR-M在促进Tpex簇形成方面的优势，Tpex群是对PD-1 ICB疗法的主要响应细胞，在T细胞耗竭时仍具有长期增殖潜力、多能性以及再生能力，并表现出干细胞样特性，决定免疫治疗的最终疗效。
总结
本研究开发了一种mRNA-LNP递送系统，用于对晚期腹膜播散性晚期肿瘤进行高效的腹膜内定制CAR-M编程。工程化的巨噬细胞通过CD3ζ或Dectin1介导的细胞内信号传导表现出肿瘤吞噬作用，同时通过TLR4或CD40信号触发促炎细胞因子的释放。这种双重机制在巨噬细胞中维持了M1促炎表型，进一步激活了适应性免疫系统，诱导TME重塑和Tpex群扩增，使得定制的CAR-M与PD-1抗体表现出显著的协同效应，让肿瘤细胞对T细胞依赖性杀伤敏感，强调了将CAR-M与PD-1 ICB疗法相结合的必要性。
总而言之，基于mRNA-LNP的CAR-M原位编程疗法显示出广阔的治疗潜力，与传统的ICB疗法显示出强大的协同效应，在临床转化方面具有巨大的前景。
参考资料
[1]https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.07.30.605730v1.full
[2]Gomi M, et al., Delivering mRNA to Secondary Lymphoid Tissues by Phosphatidylserine-Loaded Lipid Nanoparticles. Adv Healthc Mater. 2023 Apr;12(9):e2202528. doi: 10.1002/adhm.202202528.
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