免疫治疗已成为多种恶性肿瘤的有效抗肿瘤策略，包括免疫检查点抑制和CAR-T细胞治疗，但仍存在应答率低、靶点单一、副作用大、易复发等缺点。在临床试验中的各种癌症免疫疗法中，癌症疫苗是最有前途的一种。新抗原是肿瘤细胞由于一系列肿瘤特异性变化而产生的新抗原。基于新抗原的肿瘤治疗疫苗在多种肿瘤中取得了惊人的临床疗效，显示出良好的应用前景。
个体化新抗原肿瘤疫苗作为一种新的治疗方式尚不成熟，面临诸多障碍和挑战。基于新抗原的肿瘤疫苗可分为几种类型，主要包括肽/蛋白疫苗、树突状细胞(DC)疫苗和核酸疫苗(包括DNA和RNA疫苗)，其中RNA疫苗尤其有前景。RNA疫苗能够在细胞质内快速表达抗原，从而导致强大的免疫激活。此外，它们还具有避免基因组整合和T细胞耐受性相关风险的优势。
然而，体外转录(IVT)产生的mRNA在细胞内的半衰期相对较短，因此需要额外的核苷酸修饰提高其稳定性，这大大增加了RNA疫苗生产的成本，但RNA稳定性提高有限。共价闭环的环状RNA(circRNAs)与线性mRNA相比，表现出更大的稳定性，且具有编码蛋白质的能力，可作为免疫原生产的优秀载体。
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2024年7月29日，福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙研究员和赵必星副研究员研究团队在MedComm杂志上发表研究论文：Circular RNA-based neoantigen vaccine for hepatocellular carcinoma immunotherapy。该研究开发了一种编码肝癌特异性肿瘤新抗原Ptpn2_I383T的circRNA疫苗，并证明了该circRNA疫苗的稳定性，且能持续表达抗原蛋白，有效刺激强大的抗肿瘤免疫反应，显著抑制肿瘤生长。
一、体外合成具有蛋白质翻译功能的circRNA
前期研究中，该研究团队利用小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和小鼠体内验证，筛选出能诱发显著免疫应答的突变肽Ptpn2_I383T作为新抗原靶点。研究根据新抗原采用Ⅰ内含子自剪接法体外制备编码circRNA。PCR、Sanger测序和RNase R处理证明了circRNA的环状结构。circRNA表达的EGFP绿色荧光亮度明显高于线性mRNA。研究制备了编码PTPN2突变肽和Gluc融合蛋白的circRNA，通过检测Gluc活性间接验证了circRNA可以显著表达PTPN2新抗原。相比线性mRNA，circRNA的表达PTPN2新抗原的稳定性更好，表达持续时间更长。circRNA表达蛋白的半衰期为88h，而线性RNA为27h。（图1）
图1 circRNA的体外制备与蛋白表达。
二、circRNA疫苗在体外诱导免疫应答
为增强效果，研究团队制备了表达三个重复PTPN2多肽片段的circRNA（circRNA 3×PTPN2），并体外验证了circRNA 3×PTPN2可显著增加CD80+CD86+DCs的比例，诱导DC和T细胞的活化，这些细胞免疫反应可进一步促进T细胞杀伤肿瘤细胞。（图2）
图2 体外验证circRNA肿瘤新抗原疫苗诱导免疫反应。
三、体外和体内研究表征circRNA -脂质纳米颗粒复合物
研究利用商业化脂质体in vivo-jetRNA包封编码circRNA，纯化后验证其zeta电位、包封率、直径等特征。尾静脉注射到小鼠体内后，IVIS生物发光成像显示，该LNP-circRNA Luc主要被递送到脾脏。共聚焦显微镜显示，Cy5标记的LNP-circRNA大部分进入细胞内，部分在溶酶体内。LNP-circRNA Gluc在小鼠体内表达蛋白持续11天以上，且能长效维持高水平表达，而线性mRNA只能持续9天。这表明，该LNP递送系统适用于circRNA疫苗的体内给药，且circRNA表达蛋白的稳定性比线性mRNA更好。（图3）
图3 环状RNA (circRNA) -脂质纳米颗粒(LNP)复合物的表征。
四、circRNA疫苗对小鼠肝癌皮下肿瘤模型的治疗效果
将LNP-circRNA 3×PTPN2和相应的线性mRNA疫苗尾静脉注射到皮下Hepa1-6肿瘤小鼠模型，发现两者均能显著抑制肿瘤生长，而LNP-circRNA 3×PTPN2有更高的肿瘤抑制效率，且对肿瘤生长的抑制作用呈剂量依赖性。（图4A-E）
新抗原由抗原呈递细胞呈递，随后被T细胞识别，从而引发患者的抗癌免疫反应。组织学分析显示，circRNA 3×PTPN2组肿瘤组织中T细胞浸润数量明显高于PBS组和线性mRNA组(图4F)，且circRNA 3×PTPN2能显著诱导肿瘤细胞凋亡(图4G)。circRNA 3×PTPN2对模型小鼠主要脏器无明显损伤作用，对肝功能无显著影响。总之，circRNA 3×PTPN2在小鼠皮下肿瘤模型中可发挥抗肿瘤免疫作用，抑制肿瘤生长，且无明显副作用。
图4 环状RNA (circRNA) -脂质纳米颗粒(LNP)疫苗在皮下肝细胞癌(HCC)模型中的抗肿瘤作用。
五、circRNA疫苗在原位肝癌模型中的治疗效果
研究进一步建立了Hepa1-6细胞肝内肿瘤小鼠模型验证疫苗的治疗作用，发现LNP-circRNA 3×PTPN2同样显示出优异的治疗效果，并有效延长小鼠总体存活时间，且效果比线性mRNA更佳。
为了确定circRNA疫苗诱导的先天免疫应答是针对新抗原还是circRNA本身，研究在circRNA的IRES上引入突变(CVB3结构域II缺失)进行对比验证。结果发现，不能表达蛋白质的突变型CircRNA 3×PTPN2-IRES mut无法诱导模型小鼠血清TNF-α和IFN-γ表达上调，而circRNA 3×PTPN2组模型小鼠血清中IL-6和TNF-α水平显著提高，表明circRNA 3×PTPN2通过表达的新抗原多肽引发先天免疫应答，而不是circRNA本身。circRNA 3×PTPN2治疗模型小鼠中，淋巴结DC成熟比例提高，脾脏CD25+和CD69+ T细胞百分比显著增加，脾脏中CD44+CD62L+中枢记忆T细胞的比例显著提高，肿瘤浸润性T淋巴细胞显著增加。总之，circRNA新抗原疫苗通过诱导先天性和过继性免疫反应，在小鼠肝癌皮下肿瘤模型中发挥抗肿瘤免疫作用，且整体效果优于线性RNA。（图5）
图5 环状RNA (circRNA) -脂质纳米颗粒(LNP)疫苗在原位肝癌(HCC)模型中的抗肿瘤作用
六、circRNA疫苗对Hepa1-6荷瘤小鼠的肿瘤预防作用
为了评估circRNA疫苗对C57BL/6小鼠的肿瘤预防能力，每隔7天通过尾静脉注射两次circRNA 3×PTPN2疫苗。7天后皮下注射Hepa1-6癌细胞，接种疫苗的小鼠肿瘤生长明显延迟，与线性mRNA相比，circRNA疫苗具有更好的肿瘤抑制效果。circRNA疫苗治疗组中IFN-γ+ CD8+ T细胞的比例显著上调，指示抗原特异性IFN-γ CD8+ T细胞应答增强，在外周血单个核细胞(PBMCs)中也检测到特异性的CD8+ T细胞。这些结果进一步证明circRNA疫苗通过诱导先天和过继性免疫反应，诱导抗肿瘤免疫，并阻止肿瘤的发展。（图6）
图6 环状RNA (circRNA) -脂质纳米颗粒(LNP)疫苗在预防性肝细胞癌(HCC)模型中的抗肿瘤作用
总结
研究开发了一个用于癌症治疗的环状RNA新抗原疫苗平台。与线性RNA相比，circRNA表现出更大的稳定性和更持久的蛋白表达。circRNA接种疫苗已被证明可引起显著的先天免疫反应和强大的抗原特异性T细胞反应，展现出针对各种肿瘤模型的抗肿瘤功效。由于其高稳定性和相对简单的设计过程，circRNA疫苗有望成为一种有吸引力的疫苗替代方案，具有巨大的临床转化潜力。
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