质粒 (plasmid DNA, pDNA) 作为非病毒载体，低免疫原性、无毒，可直接用于基因治疗或DNA疫苗[1]，因此制备出符合法规要求的高纯度、治疗级质粒DNA，变得尤为重要。另外，pDNA也可以用于包装病毒颗粒，作为中间原料。本文将重点介绍pDNA的性质、亲和配基改造、纯化策略和新应用。
质粒pDNA简介
天然质粒为200 bp~100,000 bp大小，存在于原核及（某些）真核细胞中[2, 3]，其携带的基因对于宿主非必需，但可以更好地适应生存环境，如抗生素抗性、代谢特殊分子（如芳香族化合物）等。作为载体工具的质粒一般小于10,000 bp[4]，由复制起点、筛选标记、多克隆位点及其它元件（如转录调控元件、翻译表达元件和蛋白标签）组成。
pDNA主要有三种拓扑形态：超螺旋、开环、和线性结构，及各自对应的多聚形式，如图1和图2。
图1：质粒DNA的不同拓扑结构示意图[1]
图2：pCMV-S2S (5.7 kbp) 质粒DNA电镜图片（15,000倍放大）[4]
超螺旋质粒 (supercoiled, sc pDNA) ：又叫共价闭环双链DNA (ccc DNA) ，是双链DNA在旋转酶gyrase的催化下，像扭麻花一样将自身缠绕形成（负）超螺旋，结构最为紧凑，利于在细胞的狭小空间内存储大量遗传信息。sc pDNA最为完整、稳定、有活性，转染效率最高[5, 6]。
开环质粒 (open circular, oc pDNA) ：如果sc pDNA的一条链发生断裂，即为oc pDNA，由细菌生长过程中自然发生、UV照射、核酸酶催化断裂、或提取等过程的机械损伤造成，并受到纯化后储存温度的影响[7]。失去超螺旋缠绕结构，形态松散。oc pDNA经过内切酶处理，可以变为线性pDNA。
线性质粒 (linear pDNA) ：sc pDNA的两条链在相邻位置发生断裂，或者经过限制性内切酶酶切，即为linear pDNA。线性pDNA可以通过连接酶变为oc pDNA[4]。
寡聚 (oligomer) 形式的串联体 (concatemer) ：可以发生在上述三种结构中，如图1中的dimer形式，整个pDNA为一条链，酶切行为与单体一致。通常出现在质粒复制后的同源重组过程[8]或复制过程当中。pDNA的插入片段越大，则寡聚-单体比例越高[4]。2009年，Christof Maucksch等[9]研究了首尾相接的二聚体形式sc pDNA对真核细胞Jurkat cells的转化及表达效率，结果表明，在电穿孔后，100%细胞表面都附着pDNA，但是由于单体 (4.7-kb, 80 nm) 和二聚体 (9.4-kb, 150 nm) pDNA在直径上的差异，造成单体的转染效率更高（相差1.3倍）。对于成功转染的细胞，二聚体的转录和基因表达效率却比单体更高，推测是由于前面的基因拷贝带着后面的拷贝一起被转录。
此外，pDNA还会发生互相缠绕 (intertwined) ，孤立的环状双链pDNA互锁成链条形状，也叫做catenanes（索烃，连环）[10]或concatenates[11]，仍为多条pDNA链。主要发生在质粒复制过程中，DNA knot意外将DNA双链交织在一起。这种结构通常不出现在质粒制备过程中，在体外使用DNA拓扑异构酶可以合成出来。
如果开环或线性pDNA的断裂，发生在启动子或基因编码区，将造成质粒无效。因此，需要分离出完整、具有功能活性的sc pDNA[12]。作为基因治疗和DNA疫苗的药用pDNA，不同法规要求sc pDNA含量FDA[13]：>80%，NMPA：≥90%。
不同拓扑结构pDNA性质有别并影响其分离：
sc pDNA的电荷密度更高：pDNA所带电荷主要来自骨架的磷酸基团，不同的拓扑结构总电荷量相似。但由于sc结构更加紧凑，电荷密度比oc更高[14, 15]，因此在离子交换层析中结合更强而晚洗脱[16]。此外，电荷强度也和序列组成（高A、T含量）等相关[17, 18]，影响离子交换选择性，需要和其它层析方法联用。
sc pDNA的碱基暴露程度更高：由于DNA为右手螺旋，而sc pDNA多为负超螺旋结构[19]，此时DNA双链是逆时针旋转的，扭应力（torsional tension，如缠绕的电话线）的存在，使得双链DNA被部分解螺旋，实际上sc pDNA中双链DNA的螺旋数量 (helical turns) 是少于开环和线性pDNA的[4]，因此造成碱基暴露更多[20, 21]，这种结构利于复制和转录等过程中DNA的解旋和链分离[22]。质粒的亲和或疏水层析中，通常会利用到不同拓扑结构的碱基暴露程度差异。
pDNA在宿主菌中的质量占比不足3% (w/w) ，纯化中除了开环和线性DNA之外，还有众多杂质，包括基因组DNA (gDNA) 在碱裂解后产生的片段、RNA、宿主蛋白HCP和内毒素等，如表1。
表1 ：细菌裂解液组分构成及质粒纯化杂质限度要求[26]
其中，gDNA和RNA的化学组成和结构与质粒类似[12]，内毒素 (pI≈2) [24]和质粒同为强负电性[25]，都对纯化造成挑战。
表2：不同拓扑结构的pDNA和宿主杂质，在理化性质以及结构上的相似性[23]
质粒的亲和层析
质粒的亲和层析，多基于生物学互作或化学结构，如固相金属离子层析 (IMAC) 、三螺旋亲和层析 (THAC) 、蛋白-DNA亲和互作、氨基酸-DNA亲和互作等。其中，前三种方式都无法有效去除gDNA，以及区分sc和oc的构象[27]。
氨基酸作为小分子亲和配基，是基于天然存在的生物学互作关系，通过原子结构研究，选择和特定的核苷酸碱基优先发生互作的氨基酸作为配基。常见的氨基酸，如精氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和赖氨酸等，都可以用于pDNA纯化，可谓一场盛宴，如表1。
表3：报道中用于pDNA亲和层析的氨基酸配基举例。（氨基酸结构引自chem.libretexts.org）
氨基酸配基 | 化学式 | 和质粒互作机理 |
精氨酸 Arginine |  | 氢键（主要和G）、静电互作[28] 、弱脂肪侧链疏水[34]提高NaCl浓度洗脱或使用精氨酸竞争性洗脱[20]。 |
赖氨酸 Lysine |  | 氢键（主要和G）、静电互作 、弱脂肪侧链疏水（类似精氨酸）[29]。提高NaCl浓度洗脱。 |
组氨酸 Histidine |  | 氢键、环堆积 (ring stacking) /疏水以及水介导的氢键[21]。降低硫酸铵 (AS浓度) 洗脱。 |
芳香族色氨酸 L-tryptophan |  | 主要为疏水互作，π-π stacking；另外，和特殊氨基酸之间的氢键、和pDNA骨架之间的离子互作也不能忽视，因为10度低温也可以结合[30, 31]。降低AS浓度洗脱。 |
芳香族酪氨酸 L-tyrosine |  | 主要为疏水互作，π-π stacking；另外，和特殊氨基酸之间的氢键，和pDNA骨架之间的离子互作，同上[31]。降低AS浓度洗脱。 |
精氨酸-碱基互作，出现在众多蛋白-DNA互作结构中，最为普遍[32]。如图3所示，精氨酸倾向于和鸟嘌呤之间发生互作（体现出序列偏好）[33]，为双配位基 (bidentate) 模式，形成两个氢键（电子供体-受体为：氢-氮、氢-氧）。互作发生在精氨酸和碱基之间，而sc pDNA的碱基暴露更加充分，且超螺旋形式让核苷酸之间的距离更近从而促进多点结合[27]，因此精氨酸亲和可以分离sc和oc pDNA。精氨酸的pKa为12，在接近中性pH条件下带正电荷，和带负电荷的pDNA之间还存在静电互作[28, 34]。因此可以通过添加精氨酸竞争性洗脱或拉NaCl梯度[34]。
图3：精氨酸和鸟嘌呤互作示意图，箭头指示电子供体到受体的方向。（红色是氧，淡蓝色是碳，深蓝色是氮，黄色是氢）[27]
但是，氨基酸作为pDNA亲和配基，选择性较差[32, 33]、载量和收率[20]较低、需要更高的盐浓度（如3M硫酸铵）促进结合，有待进一步优化。
PS配基开发-众里挑一
PlasmidSelect (PS) 为基于苯丙氨酸优化而来[26]，苯丙氨酸参与某些双链DNA互作中[35, 36]。例如，抗癌药物顺铂破坏DNA结构，形成链内d (GpG) 和d (ApG) 交联[37]，造成DNA双螺旋弯曲成L形并部分解旋，这种DNA结构会招募HMG结构域蛋白[38]，从而介导药物的抗癌活性。X射线晶体结构解析发现，HMG蛋白37位的苯丙氨酸和双链DNA (G8, G9) 之间存在氢键和疏水互作，将其突变成丙氨酸后互作显著减弱[39]。
基于苯丙氨酸的化学结构，2003年Lemmens等[40]发表文献，最早开发了用于质粒亲和纯化的嗜硫亲和配基，用于分离sc和oc pDNA。
图4：不同配基用于质粒DNA嗜硫亲和层析结果图[40]
如图4，碱裂解后的pUC19质粒 (6125 bp) 首先经过Sepharose 6 FF组分分离去除RNA等低分子量杂质干扰，并置换到2 M硫酸铵 (AS) 中，将此含有sc和oc pDNA的样品，上柱纯化。对于图a、b、c的配基，oc pDNA穿透，sc pDNA挂柱并在AS浓度下降过程中一早洗脱下来（图a即为PlasmidSelect，2-巯基吡啶）。对于图d、e、f的配基，oc和sc pDNA都不结合，全部穿透。因此，对于质粒结合，配基需要含有芳香环（因此图d不结合）和至少一个硫醚结构（因此图e、f不结合），这也暗示了两种互作机理的存在：
1
含氮芳香环：参与到与sc pDNA之间的插入式π-π 疏水互作 (intercalating hydrophobic π-π type of interaction) [40]。
2
硫醚：推测硫作为电子供体，参与到和特定核苷酸之间的电荷转移 (charge transfer) [40]。
实际上，供电基团并非越多越好，例如在芳香环侧链取代上更多的硫、氧和氮，或者最多两个卤素，即加入更多的供电基团，会增强pDNA和配基之间的互作，同样为2 M AS时oc pDNA挂柱占据载量，同时sc pDNA洗脱电导需要进一步降低[40, 41]。另外，由于结合太强，无法优化为维持2M AS的同时拉NaCl梯度洗脱，不利于内毒素等杂质的去除。上图C配基的结构也有同样情况[40]。
上述两种互作模式都和碱基相关，因此对于碱基暴露更充分的sc pDNA具有高选择性。嗜硫亲和作用的存在，使得PS的选择性（分辨率）高于普通的疏水层析[42]。
PS结合缓冲液中硫酸铵，作为溶致盐 (lyotropic salt) ，有效夺取样品表面的有序水，促进疏水吸附。洗脱时：
1
单独拉AS梯度进行洗脱，直至水。sc pDNA和痕量内毒素会发生共洗脱而不利于杂质去除。
2
有趣的是，在维持高浓度AS (~2 M) 的情况下，仅通过增加NaCl浓度梯度（0-2 M过程中），即可以先后洗脱oc和sc pDNA（二者大部分碱基隐藏在内部，相对低疏水性[43]）；继续提高NaCl浓度至3M饱和浓度，也无法洗脱残留的RNA（碱基暴露更加充分）、内毒素（Lipid A区疏水）及某些疏水性质蛋白。这些杂质因为疏水性更强，只能通过降低AS浓度来洗脱。
图5：PlasmidSelect用于质粒亲和层析结果图
图5为PlasmidSelect亲和层析经典图，经过Sepharose 6 FF分子筛组分分离的pUC19样品中，掺入碱裂解粗样品（含RNA）和2.5 ug/mL荧光标记的内毒素，并将硫酸铵AS浓度调整至2.25 M。使用PlasmidSelect进行质粒分离，在维持2.25 M AS的情况下，仅拉NaCl梯度进行质粒洗脱（虚线为电导，实线为OD 260 nm）。
平衡阶段，非核酸类杂质穿透；
0-2 M NaCl梯度过程中，oc pDNA先洗脱（图4为2M AS，oc pDNA为穿透），sc pDNA后洗脱；
继续降低AS梯度至水的过程中，RNA、内毒素（点线，柱状折线图）以及某些蛋白杂质才被洗脱下来。
PlasmidSelect可以通过NaCl梯度进行洗脱，提示可能还存在离子对互作 (ion-pair interactions) [40]。增加配基上亲水的供电基团可以提高对oc和sc的分辨率，这可能由于亲水性的增加，促进了配基和磷酸骨架之间互作[41]。类似表3中的芳香族氨基酸。因此，从层析行为上，PS更加类似复合模式配基。
质粒纯化策略
基于PlasmidSelect的高选择性，Cytiva开发了经典的质粒纯化三步法[44]，适用于实验室到GMP级别放大。随着技术革新，基于PS的两步法也悄然兴起，并被Cytiva Fast Trak中国成功开发[45]。
图6：Cytiva质粒纯化工艺路线
三步法解析：
通常，和pDNA理化性质非常接近的RNA会被首先去除，避免占据后续步骤载量或造成聚集堵塞[26]。前述Sepharose 6 FF分子筛为经典方法，在~2 M硫酸铵AS（效果最佳）的高盐条件下，RNA发生明显皱缩 (compacting) ，结构更加紧凑，可以充分进入填料孔隙中，走内水；pDNA因为其超螺旋结构受AS影响较小，从而被排阻。研究中AS浓度需要控制在1.5-2.7 M范围内并衔接下一个层析步骤：完全不加盐会造成RNA和pDNA出峰重叠，高于2.7 M AS则会造成pDNA同样发生皱缩而进入填料孔隙中[26]。该步骤目前可以替换为Capto Core 700复合模式填料，5 μm的钝化外壳用于尺寸排阻，内部的复合模式辛胺配基用于结合杂质；前面也可以加一步沉淀去除大部分RNA，提高对杂质的载量[45]。RNA还可以通过CaCl2[46]或硫酸铵[47]沉淀法去除，但收率、纯度和稳健性往往不高。
PlasmidSelect (PS) 作为中纯或精纯，为上好方案，可以有效分离oc和sc pDNA，对于3–14 kb质粒都适用[40]。由于PS亲和的解离过程动力学比较慢 (slow kinetics of the elution) ，在PS洗脱过程中建议增加孵育时间，提高样品收率[26]。Cytiva最新产品Capto PlasmidSelect载量≥ 3.0 mg超螺旋质粒/mL。针对不同pDNA样品，可以进行实验条件优化。该步骤也可以替换为疏水层析如Cytiva Capto Phenyl ImpRes（苯基），但如前所述，其选择性不如PS。
经典三步法的最后还有一个离子交换，去除剩余少量杂质，如内毒素以及痕量RNA、gDNA等，并置换buffer以去除AS。由于binding buffer为0.4 M的NaCl，绝大部分内毒素穿透[40]，可能极少量残留在柱子上有待CIP去除[26, 48]。该步骤也可以拉线性梯度。填料已经由合成骨架Source 30Q，升级为收率更高的刚性琼脂糖骨架Capto Q ImpRes。还可以尝试复合模式填料Capto adhere，或使用膜层析Mustang Q[49]提高通量。
PlasmidSelect用于质量鉴定
sc pDNA和oc pDNA的分析，通常使用琼脂糖凝胶电泳 (AGE) 、毛细管电泳法 (CGE) 或HPLC。
根据样品的出峰顺序，样品的移动速率在AGE胶上主要由分子大小决定（各种拓扑结构的单体在dimer前面，如图7），而在CGE中则主要由拓扑结构决定（单体和聚体的出峰顺序都是依次为sc、oc、linear pDNA，如图8）[4]。
图7：不同拓扑结构pUC19琼脂糖凝胶电泳图。[4]
图8：不同拓扑结构pUC19毛细管电泳峰图。[4]
AGE分辨率有限，难以区分超螺旋二聚体和开环单体（可以进行特殊酶解）[50]，受电泳条件影响较大，且定量不准确。CGE因其高分辨、灵敏度及重复性，被建议用于质粒的质控过程和定量[4]。
质粒DNA的HPLC分析，一般使用离子交换（如Cytiva Source 15 PHE column[43]）或疏水层析[51]。PlasmidSelect也可以用于pDNA的快速定性分析[52]，使用分子筛进行组分分离后，即可上柱。
图9：HiTrap PlasmidSelect Xtra用于质粒定性。[52]
寡核苷酸纯化
随着基因治疗的发展，对于更长片段的oligonucleotides纯化，单一的离子交换层析分辨率不足。Capto PlasmidSelect可以和双链DNA发生互作，被成功用于三苯甲基修饰全长oligo和失败片段的分离（图10），加一步Capto Q ImpRes作为精纯（pH 12，结合洗脱模式），最终收获oligo纯度高于98%[53]。
图10：三苯甲基修饰D84-mer全长片段和失败片段的分离。梯度为1.75 – 0 M硫酸铵，20 CV ，buffer含50 mM Tris，pH 7.5。Load：10 mg oligo/mL resin，RT=6 min，分段收集。
纯化IgM
嗜硫亲和也常见于蛋白纯化，Cytiva特殊抗体亲和柱HiTrap lgM Purification[54]和HiTrap lgY Purification[55]，同样为2-巯基吡啶配基。由于预装柱体积小，放大时，可以选择Capto PlasmidSelect进行纯化。IgM由于为五聚体结构，其填料配基密度相对更低，通过简单调整实验条件即可使用PS成功放大。更多问题，欢迎拨打Cytiva智荟专线400-810-9118，转2号线。
PlasmidSelect用于质粒纯化两步法及寡核苷酸纯化，请扫描二维码，下载资料。
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参考文献
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2025-12-07
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