JEV｜方晓红团队开发新型细胞外囊泡制备技术

细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是通过细胞释放到细胞外间隙的膜性囊泡，主要包括外泌体和微囊泡等。EVs作为多种分子（蛋白质、核酸、脂质等）的载体，在细胞间通讯中发挥着至关重要的作用。EVs是一种天然内源性颗粒，具有良好的生物相容性、较低的免疫原性和一定的组织趋向性。目前，EVs已成为治疗心血管疾病、自身免疫综合征、神经退行性疾病和癌症在内的一种极具应用潜力的生物材料。尽管EVs具有非常明显的优势，但EVs在广泛应用于临床之前，仍面临需求量大、产量低和生物安全性等问题。因此，开发高效、安全的细胞外囊泡的制备方法仍是当前亟待解决的重点问题。

传统细胞培养和扩大规模无法解决安全高效量产的问题，而化学和物理方法虽可提高产量，但存在去除诱导剂困难和生物安全风险。据报道，根据外泌体给药方法和适应症状的选择，外泌体单次治疗的剂量范围为108-1013个颗粒。另外在体外培养条件下，每个细胞分泌的外泌体约为1000个，这是外泌体应用于癌症治疗存在的重大障碍。此外，盲目扩大细胞培养规模并不是最佳解决产量问题的方案，因为细胞的生长及衰老可能会影响EVs的质量及生理性能。为了克服这一问题，在过去的几十年里人们做了很多努力。例如，利用化学品甲醛、化疗药物等诱导细胞产生外泌体，从而提高外泌体的产量和材料利用率。在这一过程中去除化学诱导剂是非常困难且耗时的。对于临床应用，这些化学品在外泌体中的存在具有潜在的生物安全性问题。此外，物理挤压细胞形成纳米到微米大小的囊泡也是一种高效生产纳米囊泡的技术。尽管这种方法生产纳米囊泡的速率很高，但这可能会导致生物遗传物质从细胞核中被挤压到囊泡中，遗传DNA片段被靶细胞摄取后，通过激活cGAS-STING信号通路介导的强大细胞固有免疫应答，引发生物安全风险。此外，EVs还存在其他限制因素，如不能在细胞外囊泡中高效富集大量功能蛋白，因此需要通过基因工程和其他修饰操作将目的蛋白引入细胞外囊泡，但该方法效率和通量低。因此，开发高效、安全的细胞外囊泡的制备方法仍是当前亟待解决的重点问题。

图1 脱水诱导肿瘤细胞产生细胞外囊泡（DIMVs）的示意图

在本研究中，我们设计了一种新型脱水诱导细胞分泌产生细胞外囊泡的方案。这种方法非常简单，仅通过对细胞进行脱水处理，即可在短时间内获得大量细胞膜囊泡，无需使用潜在的生物有害物质。该方法能有效地从多种细胞系中产生DIMVs。系统性的优化制备条件后，DIMVs具有较高的产率，对细胞蛋白的利用度为同等条件下所提取外泌体的580倍，为大规模的细胞外囊泡制备提供了新方向。

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图2 DIMVs的基础表征

对DIMVs的理化性质、物质组成等进行了全面的分析，发现DIMVs是一种全新的具有微米直径的膜性囊泡。相比传统外泌体，虽然两者都由细胞产生，但是DIMVs表现出更广泛的蛋白质多样性，并含有更为丰富的亚细胞器成分以及较长的RNA，不含不含DNA片段，提示DIMVs在递送生物活性物质上更具优势。

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图3 DIMVs的工程化改造

另外，我们成功实现了对DIMVs的工程化改造，通过物理挤压技术实现了对DIMVs的尺寸进行任意调整，而且挤压后的囊泡能够被细胞摄取，其摄取效率与外泌体相当。利用基因工程改造，获得了可以表达目的蛋白的DIMVs，而且其产率比传统的外泌体具有更为显著的优势；最后，我们使用DIMVs成功实现了对核酸药物高效装载，而且挤压后的囊泡对核酸的装载效率要优于外泌体。综合这些结果，我们可以看到DIMVs具有极高的可塑性和适应性，通过定制化的工程化改造，可以开发出满足各种临床治疗需求的DIMVs。

图4 DIMVs对B16黑色素瘤模型的免疫治疗效果

在小鼠体内进行实验，安全性评价证明DIMVs对小鼠体重、肝功、肾功能影响极小；免疫原性评价证明肿瘤细胞源性的DIMVs能适度激活炎症，但是其强度远远小于有毒性的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），这可能与其携带大量的肿瘤相关抗原有关；体内分布成像实验证明DIMVs在小鼠体内对肿瘤具有较好的归巢效应，能有效的在肿瘤部位进行富集；以上特性证明DIMVs可能在肿瘤的免疫治疗、药物递送等领域具有较好的应用前景。使用黑色素瘤小鼠模型在成瘤前进行DIMVs注射以及肿瘤手术切除后进行DIMVs注射的方式评价了DIMVs作为肿瘤疫苗的潜力，证明DIMVs的两种免疫注射方式都能有效抑制肿瘤的发生或者复发。另外，未经修饰的DIMVs还可以诱导特异性T细胞反应，增强PD-1抗体的抗肿瘤作用，直接证明了DIMVs在未来作为肿瘤疫苗的前景。

中国科学院杭州医学研究所方晓红研究员、周卫副研究员和北京恩泽康泰生物科技有限公司赵立波博士为该论文的共同通讯作者。中国科学院杭州医学研究所博士生刘杰（与天津大学联合培养）和助理研究员申婷婷为共同第一作者。该研究工作受到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和浙江省自然科学基金等项目资助。