DEAH-box helicase 9 (DHX9)是 DEAH-box RNA 解旋酶家族的重要成员。作为一种 ATP 依赖性 RNA 解旋酶,DHX9 可解旋 RNA 或 DNA 双链体,以及 DNA:RNA 杂交体 (R-loops),使其成为 DNA 复制和转录的重要蛋白质。DHX9 与多种细胞过程有关,包括转录、翻译、mRNA 衰变和 RNA 转运.此外,DHX9已成为肿瘤发生的重要参与者感染和自身免疫性疾病。人DHX9基因位于染色体1q25上的前列腺癌易感位点,假基因DHX9P定位于染色体13q22。该活性基因由29个外显子组成,编码1270个氨基酸,蛋白大小为140 kDa(见图1)。DHX9包含一个由8个基序组成的解旋酶核心结构域。核心区域为两个RecA样结构域,基序I-III位于结构域1中,基序IV-VI位于结构域2中。DHX9 N末端包含2个双链RNA结合结构域(dsRBD)。最小反式激活结构域(MTAD)是RNA聚合酶 II (PolII) 相互作用的位点。解旋酶相关结构域2(HA2)位于解旋酶核心结构域的C末端附近。在DHX9的C末端有一个寡核苷酸/寡糖结合折叠(OB-fold),重叠的核定位/输出信号,以及一个能够结合单链核酸的富含甘氨酸的RGG盒。图1 DHX9蛋白结构
2. DHX9 抑制剂筛选:两种方法可选择,ADP-Glo 和 Unwinding 实验。
DHX9 ADP-Glo实验原理见图2, DHX9解螺旋需要消耗ATP,ATP转化成ADP,使用试剂盒检测ADP的生成量来反应DHX9的酶活性,加入试剂盒中的第一个试剂可以将实验中未反应的ATP消耗掉,第二个试剂加入后会将实验中产生的ADP转化为ATP,并且里面含有荧光素酶的底物,最后使用酶标仪的化学发光模块检测信号值。
Unwinding实验原理见图3,底物是由一段Cy5标记的RNA序列,BHQ2标记的DNA序列,同时与RNA互补链进行退火得到的。正常情况下Cy5和BHQ2相互靠近Cy5的荧光可以被BHQ2淬灭掉;当加入DHX9后,开始进行解链,Cy5标记的一段被解链后远离BHQ2,其荧光可在酶标仪Ex/Em:620/685nm处被检测到。图2 DHX9 ADP-Glo实验原理
图3 DHX9 unwinding 实验原理
1.DHX9 蛋白表达
3.DHX9 unwinding 实验
DHX9 protein(150-1150)
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