国内首家：IPHASE ABC家族P-gp转运体膜囊泡研发成功！

P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）属于ATP结合盒转运体（ATP Binding Cassette，ABC）蛋白家族，是一种ATP依赖性的跨膜外排转运蛋白，在人体中主要由多药耐药基因（multi-drug resistance 1，MDR1）又称为ABCB1基因编码。P-gp与多药耐药和药物相互作用（drug-drug interactions，DDI）都有关，美国、欧洲和中国的药品监管部门相继出台指导原则，将转运体介导的DDI研究列为评价新药安全性和有效性的重要指标，也明确指出应通过体外研究评估在研药物是否为P-gp的底物、抑制剂和诱导剂，为体内研究提供参考。

基于以上需求，IPHASE/汇智和源继成功构建SLC转运体细胞，包括OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2-K后，又成功构建国内首家P-gp转运体膜囊泡，助力新药研发。

P-gp是药物发现中最为熟知的外排转运体，可从多种细胞中排出化合物，最早于1976年由研究人员首先在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞株的质膜上发现，是第一个被克隆的ABC转运蛋白。

在人体中，P-gp最初被认为是导致急性髓系白血病多药耐药（multi-drug resistance，MDR）的外排转运蛋白，后来逐步发现它存在于多种组织细胞中，如全身各种上皮细胞、肝 细胞、肾细胞，在血液细胞和免疫细胞上也有表达。P-gp主要主动运输各种疏水化合物，包括小分子化合物、生物碱、以及各种天然或人工合成的有毒物质。

P-gp 由1280个氨基酸残基组成，由于糖基化程度的差异，分子量在130~190 kDa之间。P-gp分子包括N端和C端两个同源片段，每个片段各有6个疏水性跨膜区(transmembrane domain, TMD)和1个亲水性的ATP结合区(nucleotide binding domain, NBD)。这些跨膜结构区与中性或带正电的亲脂性药物结合，激活了P-gp的 ATP 酶活性，2个ATP水解释放的能量供转运 1个药物分子，将药物直接从脂质双分子层转运到细胞外，降低药物的细胞内浓度，从而导致多药耐药。

目前，体外评估由ABC转运体引起的DDI模型主要包括膜囊泡系统、基于极化细胞的双向转运系统以及“三明治”培养肝细胞。

2.1 膜囊泡系统

膜囊泡系统是研究在研药物是否为P-gp的底物和抑制剂的最常用的模式。膜囊泡可通过感染昆虫细胞（如Sf9或Sf21），或转染哺乳动物细胞（如HEK293、HeLa、V79或MDCK）等进行制备。囊泡外翻后，原本表达在胞内的转运体将被外翻至囊泡外，与药物共孵育时，药物直接作用于外翻转膜上的转运蛋白，转运蛋白可以将药物转运到囊泡内，可检测药物的吸收而非外排，即测定囊泡内药物含量即可反应转运体对药物的作用。该模型不但具有操作简便，无需进行细胞培养的优点，更主要的是如果化合物分子量大，不易透过细胞膜时，细胞模型将无法研究药物的转运机制，而外翻膜囊泡模型则不受化合物渗透性的影响。

 图2 膜囊泡系统的作用机理

2.2 基于极化细胞的双向转运系统

基于极化细胞的双向转运系统是指能够自发极化形成完整细胞单层的细胞系，如Caco-2、MDCK、LLC-PK1等。将细胞接种在Transwell小室上，培养至形成完整的极化细胞单层，将受试药物添加到单层细胞的顶端（apical，AP）或基底侧（basolateral，BL），测量渗透入接收室中的药量，根据AP→BL（吸收）和BL→AP（流出）两个方向上的表观渗透系数（apparent permeability coefficient，Papp）计算外排率（efflux ratio，ER），评价化合物是否为该ABC转运体底物。此外，通过测量探针底物在BL→AP方向的净流量或ER值的变化，也可以进行化合物对特定转运体抑制作用的评估。

2.3 三明治培养肝细胞

肝细胞中除了含有丰富的药物代谢酶，还表达多种重要的转运体。三明治培养是将肝细胞培养于两层胶原之间，底层为鼠尾胶使肝细胞贴壁，上层为Matrigen胶使其形成肝板样结构。培养几天后，肝细胞形成完整胆小管网络并同时保持紧密连接，且肝脏转运体正常表达并定位于恰当的膜区域，可用于转运体功能研究。

作为体外研究生物试剂引领者，IPHASE以HEK293为载体，成功构建转染重组P-gp转运体，并通过特殊的手段制备成外翻膜囊泡，助力药物转运体介导的DDI研究。

IPHASE技术人员以终浓度为1μM的他林洛尔（Talinolol）为底物，分别于ATP和AMP两个不同的条件下与P-gp囊泡进行孵育，通过LC-MS/MS检测他林洛尔的转运情况，结果显示P-gp转运体膜囊泡ATP组的转运活性为AMP组的5.8倍，高于《药物相互作用指导原则2020》规定的2倍，表明P-gp转运体膜囊泡构建成功！

图3 他林洛尔转运结果分析

除ABC转运体囊泡P-gp外，IPHASE已成功推出全面匹配指导原则需求的SLC转运体细胞及配套产品，供客户自行选择。同时，ABC转运体囊泡BCRP也正在优化中，敬请期待……

参考文献：

[1]曾怡馨,蒋建东,孔维佳.P-糖蛋白抑制剂研究进展[J/OL].中国药理学通报,1-6[2024-10-14].

[2]雷燕,张建华,张明,等.P-糖蛋白抑制剂研究进展[J].广州化工,2016,44(06):27-30.

[3]杨慧莹,赵丽,郭青龙.P-糖蛋白抑制剂的研究进展[J].实用老年医学,2011,25(02):165-169.

[4]《药物相互作用指导原则2020》

IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为食品、药品、化学品等的遗传毒性研究提供便捷产品，望广大科研工作者来电咨询，咨询热线400-127-6686。

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