FDA《药物开发过程中药物代谢/药物相互作用研究：体外研究》介绍

审评四部审评七室     光红梅 审校

I．前言
    药物进入体内后可以通过原型的形式或者代谢成一种、多种有活性的或无活性的代谢产物被清除。当药物主要以代谢方式清除时，代谢途径对药物的安全性和疗效以及使用说明有很大的影响。如果通过单个代谢途径清除，代谢速度的个体差异会导致药物或代谢产物在血液和组织中的浓度有很大的差异。在某些情况下，差异显示出双峰分布（bimodal distribution），提示存在遗传多态性（例如CYP450 2D6，CYP450 2C19，N-乙酰转移酶）。当遗传多态性影响清除的一个重要代谢途径时，可能需要大的剂量调整以便安全和有效地使用药物。遗传药理学已经影响到了治疗学。对于一种主要经CYP450 2D6代谢的药物，大约7%的白种人不能代谢这种药物，但其他种族人群中不能代谢这种药物的百分比远低于这个值。其他酶代谢途径（主要是CYP450 2C19和N-乙酰转移酶），也有类似情况。至少同样重要的是，许多酶代谢清除途径包括大多数经CYP450酶的代谢途径，可以被同时合并应用的药物抑制或诱导，因此，在某些个体可见合并用药时药物浓度的明显改变。药物间相互作用可以导致血液或组织中药物或代谢产物的浓度明显降低或升高，或毒性物质在体内蓄积（例如某些抗组胺药物-抗真菌药物之间的相互作用）。在一定程度上，这些类型的变化可以改变新药的安全性和疗效，特别是治疗范围窄的药物。
    如果了解了药物代谢途径和可能的相互作用，有时就可以使用某种在血浓度不可预测时会产生过高毒性的药物。由于这些原因，在药物开发的早期阶段一定要知道药物是主要以原形排泄还是以一种或多种代谢途径排泄。如为后者，应知道其主要代谢途径。这一信息将有助于认识个体间或个体内代谢差异的意义和某药物-药物相互作用和其他相互作用的重要性。这些信息还有助于明确某些代谢产物的药理学特性是否需要进一步探索。
    这份FDA的行业指南提出了有关当前药物代谢和相互作用体外研究方法的建议。本指南旨在鼓励在体外常规、全面评价药物代谢和相互作用，只要这些研究可行和恰当。与所有FDA指南文件一样，建议的内容并不是一定要做的，而是提供给药物研发者，让他们考虑作为一种方法，解释潜在的重要安全性问题。FDA认识到各种方法的重要性有差异，具体取决于正在开发的药物以及药物将来的临床应用。FDA还认识到临床观察可以解释本文件中认为以体外研究解释更容易的一些同样的问题。但就提供的信息广度而言，本文件中描述的方法是有效而低成本的，这些方法还能减少或取消进一步临床观察的要求。这一具体的指南针对的药物类别很广，即分子量小于10000道尔顿的分子。
    虽然在体外评价药物代谢和药物相互作用领域已经取得了充分的进展，从而能够编写本指南，但还需要其他工作以便能够更广泛深入地描绘药物体外代谢（包括诱导和抑制）和随后临床研究的意义以及制订产品说明书。由于药物体外代谢的评价是在药物开发和管理方面一个进展迅速的领域，本指南可能需要定期修订。
     FDA的评审科学家一直对药物代谢和药物相互作用对药物安全性和疗效的影响感兴趣。因此，本专题的讨论也包含在FDA的其他指南文件中，其中包括药物临床评价的一般考虑（FDA77-3040），可能用于老年人的药物研究指南（11/89）和药物临床评价中性别差异的研究和评价指南（58 FR 39406，1993年7月22日）。若想获得这些文件请联系药物评价和研究中心的药物信息科。
II．观察和结论
以下一般观察和结论是本指南中建议的依据：
l 人体内循环的母体药物和/或其活性代谢产物的浓度是想要的药物作用和/或药物不良作用的效应物。
l 体内药物浓度的主要调节因素之一是清除率。代谢是决定清除率的重要因素之一。
l 即使对于无明显代谢的药物而言，这种药物对合并使用药物的代谢也可能有潜在的重要影响。
l 由于代谢的个体差异，血浓度也可出现大的差异。某些药物如三环类抗抑郁药物，血浓度差异的幅度显示不同等级。当一种药物抑制另一种药物代谢时，药物-药物相互作用也有类似的较大的作用。例如酮康唑使特非那丁母药的浓度显著升高，导致QT间期延长和尖端扭转型室性心动过速。
l 最近在获得和使用人体组织和重组酶用于药物代谢和药物-药物相互作用的体外研究方面也取得了重大进展。
l 建立一种药物及其代谢产物的灵敏和特异性的检测方法，对于药物代谢和相互作用的研究非常重要。建立这些检测方法一直是药物开发计划中需要首先考虑的事情。一旦有了可靠的检测方法，就具备了体外评价药物代谢和药物-药物相互作用以及解释这些结果的技术。
    本文件中描述的体外研究是建立有关药物代谢和药物相互作用信息的一系列方法。另外，还有机制方面和经验的临床研究方法可以提供进一步的信息。认真设计综合的方法可能在最短的时间和以最低的费用得出理想的结果，这一贯如此。代谢作用和药物-药物相互作用应当尽早考虑并在药物开发过程的后期也应考虑。设计妥当的药代动力学/I期研究可以得到有关药物代谢、相关代谢产物以及实际或可能的药物相互作用方面的重要信息。例如II期和III期临床试验中经过药代动力学筛查获得的血浓度数据，也可显示相互作用或明显个体差异。由于临床试验方案有时限制合并用药的使用，一些后期的研究对于提示可能的相互作用信息有可能不是最理想的。减少对合并药物治疗的排除，并在试验用药给药前后测定血浓度（相互作用筛查），以及更频繁地测定药物血浓度，可以使后面各期临床研究更加有价值。如果可以发现有意义的代谢产物和前体药物，并描述它们的药理特性，那么所有这些研究将更有提示意义。
根据遗传多态性或其他容易识别的因素，如年龄、种族和性别，识别患者组中的代谢差异，有助于指导这些人群中的剂量研究。这类信息也有助于改进产品说明书中的给药建议、让处方医生能够预见必要的剂量调整，从而有利于安全有效地使用药物。事实上，在某些情况下，一种药物的毒性如果不可预测和不可避免，其毒性反应水平就不能接受，但只要理解了如何调整剂量以避免毒性反应，则这种药物也可以上市销售。
III．药物代谢和药物相互作用体外研究的技术和方法
    评价体外药物代谢的目的：（1）发现影响试验药物及其代谢产物的所有主要代谢途径，包括负责清除的特异性酶和形成的中间体；（2）探讨和预测试验药物对其他药物代谢的影响以及其他药物对试验药物的影响。如可行，试验药物及其主要代谢产物的药理学作用也应研究。知道某种药物不是某个代谢途径的底物也有帮助。例如，如果在药物开发早期知道一种分子不是CYP450 3A4的底物或这个途径仅在整个代谢中起次要作用，那么3A4代谢可能被酮康唑和红霉素这些药物抑制以及代谢可能被利福平和抗惊厥药诱导的担忧会减少或消除。体外研究还提示，一种药物本身是否为常见代谢途径的抑制剂。对于经相同途径代谢的药物，一种药物抑制其他药物代谢的可能性总是存在的。最早发现奎尼丁有这种可能性，奎尼丁是CYP450 3A4代谢的底物，也是非常强的CYP450 2D6的抑制剂。
A．细胞色素P-450、微粒体和相关工具
1．评价试验药物的代谢
    体外研究药物代谢（涉及的酶、形成的代谢产物和可能的抑制剂）最成熟的工具与细胞色素P450超家族中的系列酶相关。这些酶负责人体内所用的大多数药物的代谢。代谢通常见于肝脏，但这些酶（特别是CYP450 3A4）在肠道代谢中也很重要。人肝微粒体提供了研究CYP450代谢最方便途径。微粒体是通过差速高速离心获得的亚细胞组分。所有CYP450酶是从微粒体组分收集到的。在微粒体内或整个肝脏中保存在低温下（例如-70℃），CYP450酶的活性可以保存多年。对于CYP450介导的反应的辅因子的要求已经非常明确地描述，主要包括氧化还原维持系统如NADPH。对于多数药物代谢酶，有或无事先表型分类的肝微粒体可以在市面上获得。
在识别研究用新药清除的代谢途径时，除非基于特定目的，一般应使用来源于几个供体的微粒体，不论是单独还是汇总使用，以避免依赖于缺乏一种或以上代谢途径的微粒体。当每个主要途径使用选择性化学抑制剂时，新药的代谢途径很容易被证实或排除。认真考虑抑制剂和底物的孵育浓度，对于维持一种选择性的方法非常重要。例如奎尼丁和酮康唑在浓度低于1微摩尔时分别为相对选择性的2D6和3A4抑制剂，但在高浓度时也可抑制其他CYP450酶，而已知在高浓度时的这种抑制作用没有临床意义。CYP450酶特异性抗体也可用于尽力获得代谢途径的选择性抑制，但目前由于抗体不能在市面上广泛获得，它们的选择性未完全阐明，与化学抑制剂相比，抗体抑制结果的实验室间变化大，因此这种方法受到限制。
    已经克隆出常见CYP450的cDNA，并且已经在多种细胞表达了人重组酶蛋白。在采用微粒体确定了明显的代谢途径后，使用这些重组酶可提供非常好的方法以证实微粒体中发现的结果。
    在完整的肝脏系统，辅因子是自足的，并且保存了关联酶的自然取向，因此可以获得肝脏代谢最完整的表现。离体的肝细胞和精确切片具有所需要的这些特征。放射标记的药物在这一阶段非常有帮助。但这些标本的一个主要问题是酶活性不能稳定保持24小时以上。克服这一局限性将对研究酶活性的诱导作用有价值。
    体外研究可以识别新药的重要代谢途径及其这些代谢途径所形成的代谢产物。这一信息的临床意义一般应当经临床研究证实。经体外研究未发现某些代谢途径可以避免进一步临床研究的必要性，或至少有助于针对这些研究的设计。
2．评价对其他药物的作用
    人微粒体也是筛查新药对常见CYP450途径的影响以及快速提供最初的有关药物-药物相互作用最有用的工具。对主要代谢途径影响的一般评价可以通过同时孵育研究用新药与标准的探针化合物而获得，对于许多CYP450途径已有这些探针化合物，实验进行得特别快且直接，不需要特殊仪器。一般而言，如果试验药物恰当的浓度和所建立的探针一起使用，体外阴性结果（未发现相互作用）是可靠的。阳性结果提示需要进一步的临床评价。
B．其他肝药酶
    虽然CYP450超家族是占主导的一组代谢酶，但人体内还有其他类别的重要的药物代谢酶，其中包括负责乙酰化、甲基化、葡萄苷酸化、硫酸化和去酯化（酯酶）的酶。这些酶的体外方法的应用并不像CYP450酶那么广泛，但已经取得了相当大的进展，并且还在得到进一步的研究。
    除了CYP450酶以外，微粒体还含有其他酶，包括各种转移酶。对于共轭反应途径，补充含有结合部分的微粒体制剂作为添加的辅因子已经成功。微粒体部分不含有细胞质（可溶性的）酶，但采用其他亚细胞成分（例如S9）易于研究。
C．胃肠道药物代谢
    代谢研究和开发的许多重点一直集中在肝脏，因为这一器官总是被认为是药物代谢的主要部位。但对于具体的药物，其他组织可能占优势（例如肾脏或胃肠道粘膜）。由于大多数药物是口服给药，因此胃肠道粘膜的酶对药物进入体循环的影响受到越来越多的关注。对CYP450 3A4代谢途径敏感的药物生物利用度可降低和/或发生变化。因此明确药物对CYP450 3A4代谢的敏感性不仅对于识别清除途径，还对预测首过消除代谢的可能性非常重要。
D．不同动物间代谢比较和动物数据的其他用途
    动物毒理学研究是评价人体暴露安全性的重要部分。比较代谢一直受到关注，近年来更受重视，目前许多药物开发计划对动物中代谢产物进行了广泛深入地描述。这项工作尚未常规与人体内平行发现联系起来，但是有了人体代谢研究的工具，就有机会可以重新着重于和强化动物中药代动力学和代谢研究的目标。
动物研究提供了一种方法，可以明确人体外代谢研究中生成的新化学物质是否具有药理学（毒理学）活性，以及这些物质与母体化合物比较时情况如何，这常常是决定药物-药物相互作用或遗传差异的一个重要因素。采用体外研究早期发现人体内清除的代谢途径和代谢产物可以为临床前研究提供明确的方向。
    对体外研究和相应的临床随访研究的有效应用是对人体内和动物体内药物和代谢产物的暴露情况进行比较。合理的相似暴露量支持具体动物类别与人体潜在危险评价的相关性，暴露量的差异（例如在动物体内为毒性代谢产物，而在人体内则否）有助于解释临床数据。这种研究越早开展，则使用这一信息对临床研究进行计划和解释就更容易。虽然使用体外技术以明确非临床试验代谢相关性最大的动物可以提高这些研究的价值，但选择恰当的动物或品系并不是一件简单的事情。毒理研究中需要特定动物和品系的历史对照数据和既往经验限制了根据与人代谢途径的相似性选择动物和品系的能力。尽管如此，试验动物和人体之间大的代谢差异可以降低这些研究作为人体内安全性预测指标的可靠性。
IV．体外研究与体内研究的相关性
    全面理解体外代谢和体内代谢的相关性仍在不断发展中。妥善开展的体外研究和体内研究之间已经证实有很强的相关性，但在完全验证这些相关性之前，需要相当大的努力，包括这些相关性可能存在什么限制。当体外与体内研究之间出现差异时，以体内研究结果为主。但在许多情况下，体外研究容易开展，并且费用较低，因此可作为一个恰当的筛查机制从而可以除外重要的代谢途径，因而没有必要进行体内试验。如果体外研究提示对“CYP450 2D6是否代谢这种药物”回答为“否”，那么不需要明确慢代谢表型的影响或研究CYP450 2D6抑制作用的临床研究。但由于体外研究不能妥当界定代谢途径的重要性，如果体外研究回答“是”，那么另外的临床研究对于回答CYP450 2D6对于清除药物是否有临床意义这一问题很重要。
    也可能需要其他信息，以确定哪些抑制剂（如有）对体内代谢有显著影响。例如，虽然药物可能在体外被充分代谢，但体内质量平衡研究可能会表明，代谢不如尿液和胆汁排泄重要。此外，体外抑制研究常常是不确定的，除非只存在相对较低程度的抑制，而中度至高度抑制需要随后临床研究证实。在这种情况下，代谢途径的抑制没有临床意义（除非患者的排泄功能严重受损），并且诱导对清除的影响也有限。一般而言，如果有一定的体外作用但作用不大时，预测体内作用将是困难的。应当以与体内相关浓度相似的浓度进行体外实验。正如前面有关化学抑制研究所提到的，在不同的浓度下不同的途径可能受影响。但当相互作用见于胃肠道时，这可能难以测定。
V．代谢研究的时间安排
    常常存在的问题是应当在药物开发的什么时候进行体外研究。申办者在药物研究中不愿意把资源分配给尚未证实有临床活性的药物。这一顾虑是合理的，并且如有可能，在着手一项主要的代谢评价之前，在短期临床研究中识别某些有用的活性，这是合情合理的。尽管如此，早期理解一种化合物是如何被代谢，可影响几种药理学类似的药物中的选择，并且得出的给药方案很有可能会检测出阳性的临床作用。努力确定最佳时间进行体外代谢研究时，重新考虑进行这些研究的原因也有帮助。前面提到的两个主要的临床原因为：（1）发现影响药物及其代谢产物的所有主要代谢途径，（2）预期药物对其他药物代谢的影响。以上目标在理解药物体外代谢特点在II期研究的启动之前会有所帮助，在对更广泛人群进行III期试验之前特别重要。这些信息可允许有效地设计临床剂量/反应、相互作用和特殊人群研究，还能在II期和III期研究中充分考虑到患者的变异和可能的相互作用。当然，即使在药物开发后期进行清除的代谢途径评价或者根本没有进行研究的情况下，也曾经有药物开发成功。但目前，如果不知道一种药物是如何被代谢的，不知道这种药物如何影响合并使用的药物或如何受合并使用药物的影响，则很难为这种药物的上市提供依据。因此鼓励申办者在开始III期临床试验之前进行恰当的代谢研究。
VI．标注内容
    每年有大量新的药物-药物相互作用被发现，处方医生不可能记住所有信息。根据获得的越来越多的有价值的资料，目前有可能对不同的酶制订同类效应的说明书标注内容，从部分数据外推的能力正在增强。采用某些类别的药物所用的同类标注类似的方式，可能会出现制定标注内容的标准化方法，这种方法可能会有帮助。例如，某些强效的抑制剂（奎尼丁抑制CYP450 2D6，酮康唑抑制CYP450 3A4）可能影响经这些途径代谢的所有药物。因此，如果发现某种新药为某些CYP450酶的底物，即使缺少具体的数据，也可预期会有某些作用。同样，知道什么代谢途径不参与药物的清除也会有帮助。当从体外研究进行概括时，外推的情况应当清楚说明。因此应当识别和区分根据外推至临床情况的体外研究获得的数据得出的结论与根据体内临床观察得出的结论。在这些情况下，应当提供某个指定时间现有的最佳建议，在获得新的信息时应当更新同类作用。以下文本是根据体外研究进行同类标注的例子：
虽然尚未开展临床研究，根据CYP450 3A4对这种药物的代谢，酮康唑、伊曲康唑、红霉素和葡萄柚汁可能抑制其代谢。而且，利福平、地塞米松和某些抗惊厥药物（苯妥英、苯巴妥、卡马西平）可能诱导这种药物的代谢。因此如果患者使用这种药物时已经调整到稳定的剂量，在开始使用这些诱导剂或抑制剂药物中的任何一种时，预期有必要进行剂量调整以防止毒性反应或治疗失败。
以下的例子证明同类作用应当加入到什么位置，以及在何处说明药物抑制效果的信息：
    这种药物经CYP450 3A4代谢。在临床剂量下，药物本身并不抑制其他3A4底物的代谢，但确实会抑制经CYP450 2D6途径代谢的底物的代谢。
    由于包括许多可能的相互作用的趋势，有时不清楚是否有些不属于相互作用。在这种情况下，注明正面和负面预期的标注内容可能有帮助。例如：这种药物是CYP450 1A2的底物。虽然观察到其代谢被环丙沙星抑制，但奎尼丁、红霉素、酮康唑和伊曲康唑不是抑制剂。
VII．相关应用和考虑
    评价可能的药物-药物相互作用的同样技术也可提供与社会、环境（如吸烟、饮酒、饮食如葡萄柚汁）和遗传因素对治疗影响相关的信息。例如，一些研究证实吸烟是CYP450 1A2酶的强诱导剂。因此，建议吸烟并使用茶碱的患者增大茶碱的剂量。将来诱导和抑制的证据也可能通过体外研究建立。消旋药物的代谢描述应当按照以往的有关立体异构体开发指导和指南。特别指出的是，如果需要开发单个对映体，应当进行相关对映体而不是消旋混合物的临床前体外代谢研究。