液质联用技术中基质效应的评价方法

1. 前言
      在人体生物等效性或临床药代动力学试验中，液质联用（LC/MS，LC/MSn）技术被广泛用于生物样品中药物及其代谢物浓度的检测。液质联用技术具有高灵敏度和高特异性的显著特点，研究者往往会认为采用该技术可以简化或者省去样品的前处理和色谱分离步骤。但由于质谱检测是基于化合物离子化并通过特定的核质比来检测和定量，因此任何干扰待测物离子化的物质都可能影响检测方法的灵敏度和选择性，即引入了基质效应（Matrix Effect，ME）的概念。基质效应是指在样品测试过程中，由待测物以外的其他物质的存在，直接或间接影响待测物响应的现象[1]。由于质谱检测的高选择性，基质效应的影响在色谱图上往往观察不到，即空白基质色谱图表现为一条直线，但这些共流出组分会改变待测物的离子化效率，引起对待测物检测信号的抑制或提高。这些基质成分包含了生物样品中的内源性成分和样品前处理过程中引入的外源性成分。内源性组分包括无机盐或者胆汁中的有机盐、各种有机化合物（糖类、胺类、尿素、类脂类、肽类）和分析目标物的同类物及其代谢物。外源性组分尽管在生物样品中不存在，但同样会产生基质效应，包括处理样品的塑料管中残留的聚合物、离子对试剂、有机酸、缓冲液、SPE柱材料、抗凝管中的抗凝剂如EDTA或肝素锂等[2]。FDA在生物分析方法建立的指导原则中明确提出对于基于LC/MSn的方法，在整个分析过程中需通过适当的方法减少基质效应的影响，从而保证方法的灵敏度和选择性[1]；EMEA在《生物分析方法的验证指导原则（草案）》中更加细化了基质效应的评判标准[3]。
2. 评价方法
      目前评价基质效应的方法主要有两种：（1）柱后灌注法（Post-column infusion method）和（2）提取后加入法（Post-extraction spiking method）[4,5]。其中柱后灌注法能直观的显示基质效应对被测物色谱保留时间的影响范围和影响程度，适合在色谱方法筛选过程中评估基质效应的影响情况，为色谱条件的优化提供信息。而提取后加入法不仅能量化绝对基质效应的程度，也能提供相对基质效应的数据，因此广泛运用于方法学验证过程。
2.1 柱后灌注法（Post-column infusion method）[4]
      柱后灌注法属于动态分析基质效应的方法，将针泵及液相色谱系统通过T型进样阀与质谱仪相连。将空白样品按待测样品的处理方法提取后，利用待测样品的洗脱条件通过HPLC进行色谱洗脱，同时用针泵将特定浓度的被测物以恒定速度注入，两种溶液一并通过T型进样阀进入质谱仪，进行待测物离子信号强度检测。被测物信号响应的变化将直接反应生物基质对于被测物的影响，同时信号强度随时间的变化关系也有助于色谱条件的优化。
2.2 提取后加入法（Post-extraction spiking method）
      提取后加入法在评定LC-MSn基质效应中使用的最多，而且，此法还可用于评价绝对基质效应（absolute ME，基质效应影响分析的程度）和相对基质效应（relative ME，样品间基质效应大小的差异）。
2.2.1 绝对基质效应的评价[5]
      利用下述方法制备两组待测样品。
      Set 1：将被测物溶于非生物基质的空白溶液，如：配制成甲醇、乙腈等标准溶液。
      Set 2：提取空白生物基质，浓缩复溶形成溶液，将被测物加入此溶液中。
      将上述Set1和Set2样品引入LC/MSn系统进行分析，获得待测物和内标的信号强度，其中待测物或内标在Set2和Set1中信号强度的比值(Set2/Set1)为绝对基质效应，可以用基质效应因子(matrix factor，MF)来表示，待测物与内标MF的比值称为内标归一化基质效应因子(IS-normalized MF)[3]。绝对基质效应结果主要影响分析方法的准确度。
2.2.2 相对基质效应的评价[3]
      相对基质效应大小可以用IS-normalized MF的变异系数(CV)来判断。具体步骤如下：选择至少六个不同来源的生物基质，利用2.2.1方法测定上述生物基质中待测物和内标的MF（待测物浓度通常选择一个低浓度即可，其浓度应在3×LLOQ以内），并计算内标归一化基质效应因子，利用获得的6个内标归一化基质效应因子计算变异系数，其值应小于15%。
      如果由于某些特殊情况比如全自动在线样品处理、收集和测定过程，无法中断程序按照上述流程制备得到set1和set2，则需要考察待测物和内标在不同生物样品（至少6个不同个体的来源）中响应强度的差异，以此来证明基质效应对于未知生物样本的测定结果影响可以忽略。具体步骤如下：
(1)利用至少6个不同来源的生物样品制备一定浓度（3×LLOQ以内）的待测标准品（每个生物样品同时至少制备3份）；
(2)按正常样品测试方法测定这些待测标准品的浓度；
(3)计算精密度（CV表示）和准确度，其中CV应小于15%；而准确度平均值的偏差应在15%以内，对任何样品，如果其准确度偏差超过20%则需要额外考察并判断原因。
      对于方法验证而言，相对基质效应的结果直接影响方法的准确度和精密度，较绝对基质效应更为重要，因此EMEA在《生物分析方法的验证指导原则（草案）》中并没有就绝对基质效应作出限制标准，而是要求6份内标归一化基质效应因子的CV<15%。不过需要注意的是如果绝对基质效应影响过大，通常会表示基质对于方法的影响很大，往往导致精密度的实验结果不符合要求，因此在方法建立之初，如果条件允许，应尽可能降低绝对基质效应。
3. 克服基质效应的方法
克服基质效应的方法包括下面几种：
(1)选择合适的样品预处理方法：常用的样品的处理方法包括蛋白沉淀，液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。通常 利用LLE或 SPE制备的样品内源性杂质较少，有助于降低绝对基质效应。但样品前处理过程的复杂会降低分析检测的效率，增加污染的风险，并可能带来待测组分的损失，也直接影响待测组分的提取回收率。因此在样品制备方法的选择中要兼顾基质效应和提取回收率两方面的因素，选择合适的样品制备方法。
(2)改变被测物的色谱分离条件：即通过优化色谱分离条件使得内源性杂质与待测物分离。采用反相色谱法分离时，最初流出的主要是基质中的极性成分，而这些极性成分往往是引起基质效应的主要原因。当待测组分的色谱保留时间较短时（<3min），其受基质效应影响较大。因此，改善色谱分析条件，适当地延长待测组分的保留时间（但要兼顾样品运行时间延长带来的峰展宽、灵敏度下降的问题），有利于减少基质对测定的影响。
(3)采用性质相近或稳定同位素内标：如果绝对基质效应影响较大，但内标和被测物的绝对基质效应接近，仍可认为方法可行。但需注意的是，如果绝对基质效应太大，通常会造成方法的变异很大。而且当多个分析物同时检测时，由于存在极性差异，即使是同类物的同位素内标也很难抵消基质效应，从而造成定量结果偏差。因此在方法建立的初期，仍建议采取可行的方法降低绝对基质效应。
(4)采用小进样量。在保证灵敏度的情况下，采用小进样体积，可以适当降低基质效应。由于自动进样器的广泛应用，目前即使很小的进样体积也能实现良好的进样精密度。
(5)利用液相色谱电解质效应（LC-electrolyte effects）：利用在流动相中添加极少量不同的有机酸/碱促进待测物离子化，从而减少基质效应的影响。
(6)使用较低的流速：在LC/MS中，尤其是使用ESI离子源时，较低的流速可以使同时离子化的化合物减少，降低了待测成分与基质成分在电离过程中的竞争，从而减弱基质效应。
(7)改用不同的离子源：目前用于定量的离子源主要是电喷雾离子源（ESI）和大气压化学离子源（APCI），通常ESI对于基质效应的敏感程度要高于APCI。对于特定的化合物，特别是对于蛋白质沉淀法处理的样品，若采用ESI有明显的基质效应，更换成APCI源或大气压光离子源（APPI）可能是一种简单易行的方法。
4. 结论
      液质联用技术对生物样品分析造成的影响是个复杂的问题，受到化合物本身、生物基质、样品前处理过程、色谱条件和不同离子化模式等因素的影响，对于它的控制标准目前除EMEA的《生物分析方法的验证指导原则（草案）》较明确外，FDA、SFDA还没有明确一致的指导意见，然而在临床试验中对生物样品进行绝对基质效应和相对基质效应的考察将会是一个趋势。
      本文仅就基质效应评价的方法及如何消除或减小基质效应进行了简单的讨论，希望引起国内临床研究单位加强对生物样品分析过程中基质效应问题的重视，有意识的在研究中积累实验数据，从而进一步提高分析检测结果的准确度和精密度。

参考文献
[1]FDA guidance for industry bioanalytical method validation, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), 2001.
[2]Van Eeckhaut A, Lanckmans K, Sarre S, Smolders I, Michotte Y. Validation of bioanalytical LC-MS/MS assays: evaluation of matrix effects. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009, 877(23):2198-2207
[3]Guideline on Validation of Bioanalytical Methods (Draft), Committee for Medicinal Products for Human Use, European Medicines Agency (EMEA), 2009.
[4]Bonfiglio R, King RC, Olah TV, Merkle K. The effects of sample preparation methods on the variability of the electrospray ionization response for model drug compounds. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999, 13(12):1175-1185.
Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Anal. Chem. 2003, 75(13):3019-3030.