EMEA临床试验用生物技术药物病毒安全性评价指导原则

EMEA临床试验用生物技术药物病毒安全性评价指导原则
－－译自欧盟发布的guideline on virus safety evaluation of
     biotechnogical investigational medicinal products
审评五部 李敏 罗建辉

关键词：病毒安全性  临床试验  临床试验研究用药（IMPs）
译稿说明
      本文系国外指导原则的中文译稿，翻译自2009年2月1日由欧盟颁布执行的“Guideline on virus safety evaluation of biotechnogical investigational medicinal products”，意在向关注国内外同类技术问题评价要求新动向的业界人士提供一个信息，可作为国内研究过程中科学技术相关层面的借鉴，但不代表药审中心出台的生物技术类药品指导原则。
执行概要
      本文件为临床试验用生物制品病毒安全性提供科学性指导原则，该指导原则包括以下内容：
      1）临床前及临床试验阶段所应完成病毒安全性评价的标准及其范围。
      2）可作为参考内容用于病毒安全性评价的内部经验的范围。
      3）安全性评价中应纳入的风险评估。
1、简介
      确保生物制品的病毒安全性是一个复杂的过程，可靠的IMP病毒安全性评价是非常关键的。
      本指导原则为人用生物制品申报临床时应提交的病毒安全性研究数据及资料提供建议。本原则参考ICH Q5A（见参考文献）制定，ICH Q5A定义了药品上市申请（MAA）时应提供的研究数据。尽管ICH Q5A并未提供专供临床阶段用生物制品的相关指导原则，但其基本思想是恰当的且适用于本指导原则的。
      本指导原则提供了一种经协约认可的IMPs病毒安全性评价方法，同时适用于整个欧盟范围内的药品制造商和监管部门。本指导原则尤其有益于指导多中心临床研究，包括涉及多个国家参与的国际多中心临床试验。
2、范围
      本指导原则适用于由按照Q5A要求建立的人源或动物源细胞库经细胞培养制备的人用生物技术类IMPs。许多IMPs源于已得到良好认知的啮齿动物细胞系如CHO、NS0或SP2/0，但目前仍有一系列其它细胞系在使用和建立过程中，对于这些细胞系应该具体情况具体分析（case-by-case）。
      本指导原则适用于单克隆抗体和包括重组亚单位疫苗在内的DNA重组类IMPs的病毒安全性评价。本指导原则不适用于重组病毒或细菌类IMPs（复制型和非复制型）、减毒活疫苗或灭活疫苗的病毒安全性评价。来源于体外培养杂交瘤细胞的IMPs亦不在本指导原则适用范围内。
      本指导原则概述了适用于临床试验任一阶段的IMPs病毒安全性要求。本指导原则不适用于仅用于临床前研究的IMPs评价。ICH Q5A提供了用于上市申请（MAA）所需研究数据的要求。
3、法规基础
      欧盟的临床试验受“指令2001/20/EC”（Directive 2001/20/EC，参见参考文献）的监控，保证临床试验研究用药按照GMP规范制造是各成员国应担负的责任，上述均是临床试验研究用药评价所要求的。
4、指导原则正文
4.1 一般原则
      生物技术类IMPs病毒安全性研究的目的是为证明一个可接受的、能保证临床受试者安全性的病毒安全性水平。
一个获证上市生物制品的病毒安全性由三种互补的途径加以确保，包括：1）细胞系的筛选和检测，其他人源或动物源性原材料的筛选和病毒因子污染检测；2）下游工艺清除感染性病毒能力的判定；3）在适宜的步骤进行产品病毒污染的检测（参见ICH Q5A）。
      根据生物技术类IMP生产工艺及产品自身的性质特点，可以预期会存在较上市批准要求简化的临床阶段病毒安全性研究，这些简化表现在：第一，生产终点对生产细胞/收获液（unprocessed bulk）的病毒检测（见4.2.3部分）；第二，病毒去除验证（见4.2.4部分）。这种简化程序仅适用于ICH Q5A定义的“类型A”或“类型B”的细胞系。内部经验（见4.2.4部分）的提供也将有助于病毒去除研究资料的简化。
      除提供研究数据外，尚需提供以下包括下述几个或全部要素的风险评估：
      ●细胞系的性质和历史；
      ●细胞系特征的认知程度；
      ●生产中人源和/或动物源原材料的使用和控制情况；
      ●潜在的产品暴露于外源污染的可能性；
      ●生产商采用该细胞系进行生产的经验；
      ●特定病毒去除工艺步骤的使用经验；
      ●已发表的文献数据。
4.2 保证生物技术类IMPs的病毒安全性
4..2.1 细胞系认证：病毒检测
      临床I期实验前应按照Q5A要求进行主细胞库（MCB）病毒污染的检测。
      工作细胞库（WCB）可能在临床试验进行期间才建立，因此，对一些早期临床使用的IMPs而言，使用当时WCB尚未建立。一旦WCB建立，第一代WCB应按照ICH Q5A要求进行检测。然而，如果按照4.2.3部分/表1要求进行收获液的检测，则不要求对达到体外细胞培养代次的细胞进行病毒安全性检测。
      由于目前所使用的大多数细胞系均含有内源性逆转录病毒或病毒颗粒，且这些逆转录病毒或病毒样颗粒仍有可能在新的细胞系中出现，细胞检测中对逆转录病毒或病毒颗粒的存在应予以特别关注。
4.2.2 生物来源的原材料
      IMPs的病毒安全性需考虑用于生产的生物来源（尤其是人源或动物源）的原材料的安全性。一种以风险评估为基础的原材料病毒安全性评估方法是可行的，该风险评估注重原材料的类型和来源，原材料的工艺条件及检测，该类型原材料在药品生产中的应用背景，收获液的检测（参见4.2.3部分）。
      申报单位应提供合适的关于生物源性原材料病毒安全性的资料。本部分参考了牛血清相关指导原则和“尽可能降低动物海绵样脑组织病变传播风险”的指导原则（见参考文献）。
4.2.3 收获液的病毒检测
      与所处的临床试验阶段无关，每批用于临床试验的收获液均应按照Q5A的要求进行检测。如果适用，检测样本应包括细胞，且检测应包括采用体外法和基于PCR原理方法进行的外源病毒因子和逆转录病毒样颗粒的评价。CHO细胞系来源的原液无需进行更多的检测。对于NS0或Sp2/0细胞系进行的生产，应进行一次性的感染性逆转录病毒检测，如果存在生产用细胞系的重大变更（如生产规模），则应重新进行检测。对于采用其他种类细胞系进行的生产，需进行一次性的感染性逆转录病毒检测和体内法病毒检测（根据ICH Q5A 3.2.3部分），如果存在生产用细胞系的重大变更（如生产规模），则应重新进行检测。这些检测要求见表1。如果细胞系适于鼠细小病毒（MMV）的生长，则应考虑MMV的检测。
      在进行收获液检测时，应结合细胞系来源和生产用原材料的病毒安全性（参见4.2.2部分）进行考虑。如果应用了人源或动物源的原材料如牛血清，则可能会要求更多的特殊因子检测。
表1.收获液的检测要求

      *如果可能，检测样品应包括细胞或细胞碎片以进行细胞相关病毒检测。对于灌注式细胞培养，生产商应确定并证明最适合的样品（含细胞的样品）收集步骤，收集超出批量生产代次的细胞检测样品也是可行的；在上述情况下，应证明采用分析方法的合理性；如果已有敏感度更高的方法可表明感性逆转录病毒检测结果为阴性，则感染性逆转录病毒的检测可省略。
      §仅需在研发的特定阶段对前三批原液进行逆转录病毒或逆转录病毒颗粒的检测（如果制备批次不足三批，也可用更少批次）。
4.2.4 病毒清除（virus reduction）验证
      病毒清除验证的目的有两个，首先，进行可被视为有效灭活/去除病毒工艺步骤的特征描述和评价；其次，进行病毒/病毒样颗粒去除总体水平的定量分析，如内源性逆转录病毒颗粒。需综合细胞系的性质、生物源性原材料的应用情况和可有效灭活/去除病毒工艺步骤的性质，按照具体情况具体分析的方法进行病毒清除验证。
      跳出生产细胞系的直接病毒检测结果来看，囿于病毒检测方法的局限性，IMP依然存在潜在的由原始细胞或生产细胞培养过程中由生物源性原材料带来的未知病毒污染的风险。因而，即便在不使用生物源性原材料且细胞系已经全面检测的情况下，仍应进行IMP下游生产工艺病毒灭活/去除效果的评价。
      病毒清除验证应在临床试验开始前进行。潜在的病毒可能是有包膜病毒或无包膜病毒，病毒清除研究应包括有包膜病毒和小型的无包膜病毒，最好为细小病毒。特别指出，必须可证明所有已知收获液中存在的病毒或病毒颗粒均可被下游生产工艺有效灭活/去除。B型细胞（参见Q5A定义）含有内源性逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒，故在病毒灭活/去除验证中应采用逆转录病毒证明收获液中存在的颗粒可被完全清除。
      尽管下述的耐用性研究（如工艺参数对病毒清除的影响）并非所有情况下均要求进行，但病毒清除研究仍需按照Q5A的原则进行。需对有病毒清除作用的产品纯化步骤进行描述，评定这些步骤的灭活/去除潜在病毒污染物的能力时需考虑生产细胞系的病毒安全性（如，内源性逆转录污染物的类型和水平），生产过程中人源和动物源性原材料的使用和可能的污染水平。人用药物委员会（CHMP）在“病毒验证研究指导原则注解”中也提供了详细有用的信息。
      鼓励对一步以上的生产用工艺进行病毒清除效果研究，同时，至少应进行两个互补步骤（Orthogonal steps）的评定。互补步骤是指利用了不同作用机制进行的病毒灭活/去除的工艺步骤，有效步骤标准见“病毒验证研究指导原则注解”中的描述。不需要对预期没有明显病毒清除效果的工艺步骤进行研究。
      有效病毒清除步骤的可重复性应通过至少两次独立实验予以证明。
      在验证研究进行过程中，一旦生产条件可获知，则应在研究中采用相应的工艺参数限度（如，最差状况）。然而，在工艺研发过程中，新生产工艺往往缺少对较差状况限度的定义，在这种情况下，如果生产商可以证明采用的设定点可代表实际生产过程中的条件，则这样的设定点也是合理的。
可支持上述研究简化的情况
●如果可以证明某一步骤可有效清除包括小的无包膜病毒（如细小病毒）在内的广谱病毒，则仅进行单一步骤病毒灭活/去除步骤的研究可能即为充分的。然而，对于B型细胞，为证实存在充分的逆转录病毒去除能力，通常需要对多于一步的工艺进行评价。
●特定下游生产工艺步骤的前期应用经验。在生产商采用已建立并经鉴定的生产工艺生产同类产品时，由于采用的生产工艺相同，其它品种的病毒清除研究数据可能适用于新产品的申报。
      通常，为采用该类型工艺步骤的数据，需对工艺步骤进行谨慎的评估，包括影响病毒清除工艺参数的全面研究。如果可提供多于一个产品关于该步骤的研究数据，则这些产品在该步骤的病毒清除效率应是可比的。新产品和已确立产品该特定工艺步骤前的生产工艺也应采用相似的策略。
      应提供前期内部数据可用于新产品的依据。例如，只有当特定工艺步骤前所得到的中间产物有相似的生化性质且为采用相同的纯化工艺得到时，该工艺步骤病毒清除数据才可能作为参考数据。生产商应对作为借鉴数据用的工艺步骤进行工艺步骤关键分析和各自中间产物的组份分析。例如，对于过滤步骤，包括过滤的类型、单位过滤面积的上样量、流速、压力和病毒过滤步骤中间产物的成分；对于层析步骤，包括层析参数如柱床高度、上样量、缓冲液成分、中间产物成分和线性流速。此外，新产品可能包含前期产品不含有的新成分，故需考虑这些成分对病毒清除效果的影响。提供的分析应足够证明在两种情况下，已建立的工艺步骤在灭活/去除病毒污染方面有相似的能力。如果工艺步骤的比较数据没有足够的信服力，或不能够足以排除产品本身特定灭活/去除潜在病毒能力的影响，则应采用适宜的病毒进行至少一次研究以确保该工艺步骤可以达到预期效果。如果工艺的生产性能是明显不同的，如采用相同的设备得到了不同的层析图谱，则如上述，对该步骤应按照Q5A进行验证研究。
      发表的文献数据有助于说明某工艺步骤病毒灭活/去除的可能性，并可能为其作用机理提供一定的线索，这些因素将促进对关键工艺参数的探索和有待验证步骤最差状况下工艺参数限度的设定。
      尽管如此，病毒清除可能依赖于多种工艺参数和中间产物的具体组份。特定产品在引用已发表的病毒清除影响要素时，需要提供大量的关于工艺一致性、中间产物一致性的证明，且应确定产品具体的工艺参数未影响病毒的清除效果。此外，工艺被赋予的清除能力可能仅针对选定的病毒（如层析步骤），因此，需对文献数据进行谨慎地评估。
      鉴于早期研发阶段使用层析柱的专用性和生产批次的有限性，对IMPs生产来说，特定层析柱的再使用研究和清洁研究通常是不必要的。然而，一旦在IMPs生产中多次重复使用层析柱，则需要在病毒清除能力研究中考虑开展该项研究。
病毒清除的验证
      IMPs生产的早期临床阶段（如I期）研究数据可能应用于后续临床中，然而，IMP研发过程中可能会引入较大的生产变更，必须考虑这些变更可能会直接或间接（由评价工艺步骤外的其它变更引起）影响病毒的清除能力。因此，一旦已有的数据无法反映后续临床试验中使用的IMP生产状况时，必需在开始下一阶段临床前进行再评价。根据引入变更的类型，应重新考虑病毒的选取，在必要的情况下，应增加使用病毒的类型以提供可信的工艺清除病毒能力研究结果。即便在晚期扩大的临床试验（III期）中不需要按照Q5A指导原则进行完整的验证，生产商应证明所选用方法的合理性，其中应包括对模型病毒和已经评估工艺步骤的考虑。一旦最终生产和纯化工艺建立后，应按照Q5A进行全面的病毒验证研究。
4.2.5 分析方法的描述和定性
      在起始原材料、中间产物病毒检测或生产工艺病毒清除能力评估过程中可采用不同类型的分析方法。病毒检测方法包括广泛的基于多种指示细胞系细胞病变效应（cpe）和红细胞吸附试验的体外法检测、体内法检测和特定病毒检测（如采用PCR方法）。针对逆转录病毒检测，可以采用透射电子显微镜（TEM），不同细胞系的共培养和逆转录酶活性检测（如可采用荧光产物增强逆转录酶活性检测法（PERT））。
      不依赖于临床试验的阶段，无论定性的还是定量的病毒检测分析方法均应进行方法适用性的验证。基本上，ICH Q5A第3.2章“推荐的病毒检测和鉴定方法”和第4章“收获液的病毒检测”中的要求均为适用的。为清晰地理解分析方法且明确其是如何被控制的，应提供足够详细的分析步骤的描述，包括试剂、方法对照、检测步骤和认可标准，如果采用了概略步骤描述，在相应处注明参考文献。
      针对用于细胞库、其它起始生产原材料和收获液病毒检测的检测方法，应以表格的形式提供这些检测方法的鉴定/验证结果概述，如采用适宜阳性/阴性对照确定的特异性、敏感性、定量限和检测限等数值。无需提供关于这些检测方法的完整方法学鉴定报告，但仍需准备好这些报告以备需要时提交。
      针对用于病毒清除研究的分析方法，应提供完整的细节描述以证明该方法用于（模型）病毒颗粒定量是合适的，描述应包括关于定量限的判定、特异性的判定、方法固有的变异度、缓冲液/基质对病毒感染力的干扰、可能影响选用模型病毒对指示细胞感染能力的产品及缓冲液的细胞毒性分析等。
4.3 病毒安全性风险评估
      除提供产品的病毒安全性数据及其推算结果外，在临床试验注册时还应提供病毒安全性风险评估，4.1、4.2.1和4.2.4节所提及的因素应作为病毒安全性风险评估的首要考虑要素。与Q5A一致，细胞系病毒因子检测、所有人源或动物源性原材料的病毒因子检测、病毒清除验证、在生产工艺适宜步骤中对产品进行感染性病毒污染排除的检测均应作为风险评估的考虑部分。
      风险评估应包括每剂量中病毒颗粒数量的估计（参见ICH Q5A附录5），且应包含对所有生产工艺步骤的风险评估。
      特殊情况下，在对临床试验病毒安全性综合评估时，进行临床参数（如适应症，给药剂量，人群暴露量、研究持续时间和病人免疫状态）的权衡也是合理的。在这种情况下，需注意I、II、III期临床试验过程中一些参数是会发生改变的。临床参数不应作为病毒安全性评估的决定因素，但其可能影响从病毒安全性角度出发对临床试验审批的最终结论。
      每种情况均应具体情况具体分析。
4.4 研发阶段病毒安全性的再评价
      IMP研发过程中经常引入工艺变更，且这些变更可能影响前期已确定的病毒安全性评价结果。一旦在病毒安全性风险评估已完成的工艺步骤引入了变更，生产商应做相应记录。针对每次变更均应考虑是否需要进行病毒安全性风险的再评价。在某些情况下，可以明确引入的变更对病毒安全性风险评价无影响，但如果该变更将带来明确影响或其影响无法确定时，则需进行风险评估的再评价，且进行必要的适当的试验研究，这种情况下，应考虑涉及保证病毒安全性的所有因素。
      对于需要进行病毒清除验证研究的变更，可参照4.2.4.2部分“再验证”的相关要求。
4.5 临床试验注册文件的格式
      应认真并清晰地提交确保病毒安全性的完整程序资料，如果存在任何与本指导原则提出的最低限度要求的偏差，均应提供合理的依据。
      注册文件格式与“关于人用药物临床试验注册的要求、重大变更通告和临床试验终止公告的指导原则”要求一致，应包括一种特定的附件，例如附件2：附录2.1.A，2.1.A.2，外源试剂安全性评估，专门的TSE风险因素数据，生物技术类IMPs和其它外源试剂的病毒安全性等。应在附件中进行所有数据的汇总，在借助尽量少主文件阐释内容的情况下仍保持本部分的独立性和完整性。在需要的情况下，应提供包括细胞系检测和病毒清除研究原始数据的完整报告，确保评价过程中对IMP病毒安全性的最清晰理解。部分报告中的原始数据可有合同实验室或国际实验室提供。当申请人使用前期的内部研究数据时（如，来源于其他产品的数据），应提供额外的文件，该文件内容应保证能够进行内部数据的评价，并可证明内部数据用于新产品的合理性或支持性。
      作为病毒安全性文件的一般性考虑，提交的信息应考虑到“申请人注意事项第2B卷，第II部分V:病毒文件”中陈述的项目内容。

参考文献（技术的和/或法规的）
Directive 2001/20/EC of the European Parliament and of the Council of 4 April 2001 on the approximation of the laws, regulations and administrative provisions of the Member States relating to the implementation of good clinical practice in the conduct of clinical trials on medicinal products for human use
ICH Q5A: ICH harmonised tripartite guideline on Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin
CHMP Note for guidance on virus validation studies: the design, contribution and interpretation of
studies validating the inactivation and removal of viruses (CPMP/BWP/268/95)
Detailed guidance for the request for authorisation of a clinical trial on a medicinal product for human use to the competent authorities, notification of substantial amendments and declaration of the end of the trial (ENTR/F2/BL D(2003)).
Volume 2B of the Notice to Applicants, Part II-IX. concerning chemical, pharmaceutical and biological documentation for biological medicinal products, Part II V: virological documentation
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CHMP Note for Guidance on Minimising the Risk of Transmitting Animal Spongiform Encephalopathy Agents via Human and Veterinary Medicinal Products (EMEA/410/01 in its current version)
CHMP Note for guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products (CPMP/BWP/1793/02).
Ph. Eur. monograph on “Bovine serum” (01/2008:2262)