关于《疫苗生产用细胞基质研究审评一般原则》的补充说明传代细胞残留物质的考虑

审评五部生物制品室高恩明

摘要：本文对《疫苗生产用细胞基质研究审评一般原则》中细胞传代及其残留物要求的有关问题进行了重点阐述

目前，我国疫苗生产使用的传代细胞主要有两种，一种是非洲绿猴肾细胞的传代细胞系（Vero细胞）。另一种是中华仓鼠卵巢细胞的传代细胞系（CHO细胞），虽然《疫苗生产用细胞基质研究审评一般原则》不涉及CHO细胞的有关问题，但鉴于CHO细胞本身存在的问题及残留物质的重要性，本文对有关问题进行讨论。
CHO细胞主要作为表达载体，目前国内用于重组疫苗的表达，二十世纪九十年代上市的产品有重组乙型肝炎疫苗，现在仍有一些科研单位或企业正在研发某些重组疫苗，试图采用CHO细胞表达。
理论上，传代细胞的DNA和蛋白存在致肿瘤的可能性。目前国内的研究资料显示，CHO细胞致肿瘤试验阳性，逆转录酶试验阳性。为此，《中国药典》三部（2005版）对CHO细胞表达的重组乙型肝炎疫苗提出新的要求，要求CHO细胞残余DNA含量≤10pg/剂量，CHO细胞残余蛋白占总蛋白含量的0.05％以下，并要求在生产工艺中增加病毒灭活工艺。在药品审评中，对于未上市的新疫苗的评价，除进行技术审评之外，还需要进行效益/风险比的分析与评价。虽然CHO细胞只作为表达载体，表达的目的蛋白尚需纯化，CHO细胞的残留物质很少，但是，仍存在潜在的风险，因此不推荐新的预防用疫苗采用CHO细胞表达，更不能推荐用于婴幼儿。
近几年，我国采用Vero细胞生产灭活疫苗逐渐增多，疫苗的种类包括人用狂犬病纯化疫苗、出血热纯化疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、乙型脑炎纯化疫苗。Vero细胞是传代细胞系，理论上具有致肿瘤的可能性，已有资料报导，Vero细胞在170代以上致肿瘤试验阳性；WHO推荐134～150代，认为在该代次内未发现致肿瘤性。因此，建议我国疫苗生产些企业尽可能采用150代作为使用限定代次。
Vero细胞残余DNA、残余蛋白（包括促生长蛋白）可能对人体有潜在的致肿瘤性及其他危害，建议疫苗生产研究单位研究特异性检测Vero细胞蛋白的方法，为今后制定相关质量控制标准奠定基础。此外，目前阶段应尽量降低疫苗总蛋白含量，间接控制细胞残留蛋白。关于Vero细胞残余DNA危害，除了与残余DNA含量的多少有关外，还与残余DNA片断的大小有关，残余DNA含量越高、片断越大，其潜在的致肿瘤性越大。因此，建议疫苗生产研究单位强化纯化工艺，尽量降低残余DNA含量；此外，研究并建立检测Vero细胞残余DNA片断大小的方法，为今后制定相关质量控制标准奠定基础。
在上述采用Vero细胞生产的纯化疫苗中，乙型脑炎纯化疫苗比较特殊，因为它是国家一类疫苗，即实施计划免疫的疫苗，用于婴幼儿的免疫接种。因此，对乙型脑炎纯化疫苗的质量要求应相对严格，用于计划免疫婴幼儿使用的疫苗，采用Vero细胞生产是否合适，对于Vero细胞DNA残余量、残余蛋白含量如何要求有待讨论。目前可初步要求DNA残余量≤10pg//剂量（参照CHO细胞产品的要求），要求生产企业建立Vero细胞残余蛋白含量的检测方法并拟定质量标准。

关于《疫苗生产用细胞基质研究审评一般原则》的补充说明传代细胞残留物质的考虑

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