微生物来源药物制备工艺研究中质量控制要素探讨（一）--菌种的源头控制

审评三部张哲峰

摘要：生物合成的工艺过程不同于化学反应过程，产品质量的过程控制特点也有所不同，本文分三个方面就如何通过菌种来源、鉴定和保藏的源头控制以及发酵、提取工艺的过程控制等手段把握产品质量展开讨论。
关键词：微生物菌种制备工艺质量控制

通过微生物发酵（生物合成）获得治疗疾病的化学或生物学物质，是药物研发的一个重要途径，尤其近年来，随着生物工程技术的迅猛发展，新药物研发领域得到进一步拓宽。同时，通过对生产菌种的选育和优化获取优良菌株，提高产品质量和收率，也成为药物研发的热点领域之一。生物合成的工艺过程不同于化学反应过程，既涉及生物细胞的生长、生理和繁殖等生命活动过程，又涉及生物细胞分泌的各种酶所催化的生化反应及酶化学反应过程，对产品质量产生影响的因素远较化学合成反应多且复杂。本文就如何通过菌种来源、鉴定和保藏的源头控制、发酵和提取工艺研究及工艺参数确立的过程控制的手段把握产品质量展开讨论。
微生物发酵法生产药品的工艺过程大体相同，一般的工艺程序为：生产菌株→孢子制备→种子制备→发酵→发酵液预处理及过滤→提取及精制→成品检验→包装→放行检验。一般说来，从孢子制备到发酵属于“生物合成”范筹，从发酵液预处理到提取精制属于“化学工程”范筹。无论是“生物合成”还是“化工操作”阶段，均存在影响产品质量的重要因素。由于发酵过程的复杂性，通过对生产菌株相关要素的“源头控制”以及“生物合成”、“化工操作”阶段工艺要素的“过程控制”对于确保产品质量更具重要意义。
1、菌种来源
从出发菌（多为野生菌）到工程菌，一般要经过一系列的诱变、选育过程，菌种选育的目的是为改良菌种的特性，能够得到目标物且符合商业化生产的要求，如：优化产品组份、提高产品质量、抵抗不良条件、简化生产条件、提高产品收率等。人们从生长在土壤中的放线菌、真菌、细菌中筛选目标物的同时，已拓展到土壤中的稀有放线菌、海洋微生物和生长在特殊环境中的微生物。菌种选育的方法包括经典的自然选育和诱变育种以及现代的杂交育种、原生质体融合、基因工程等菌种选育技术，通过基因工程技术构建新药产生菌，大大加快了育种速度。选择出发菌株时应考虑出发菌株的稳定性，尽量挑选纯系菌株，以排除异核体与异质体菌株。出发菌株对诱变因素敏感可以提高突变频率，菌株的生理状态及不同的生长发育时间与诱变效应密切相关，一般细菌处理其营养体，真菌和放线菌处理它们的孢子，并以对数生长期为佳。翔实的菌种来源资料，应能详细说明从野生菌种到生产菌株进行了那些处理，以便从源头掌握产品质量信息。
得到的工程菌应具备一定的遗传稳定性，需提供传代10代以上的记录和研究资料，说明菌株在多次传代后，生物学特征以及目标物的产生量等是否发生改变、是否发生了变异，以确保菌种在生产中不会发生回复突变；同时，工程菌这种渊源关系的把握不仅便于从源头掌控药品质量，而且对于知识产权的保护亦为一种有效措施，比如，采用某机构的标准菌株为出发菌，经一系列诱变、选育得到工程菌生产目标物，但很多机构的标准菌株仅供科学研究使用，如用于商业用途须经许可，否则，将会引发知识产权的法律纠纷，同时，这种做法也不符合菌种筛选的习惯做法；以野生菌为出发菌得到能产生目标物的工程菌在过去几十年中一致是人们发现新目标物的主要途径，在菌种选育过程中获得其遗传标记，对日后申请知识产权保护、避免法律纠纷具有重要意义，需引起相关关注。
2、菌种鉴定
生产菌株是生物合成的主要基础，应能保证在特定条件下能够稳定产生目标物，同时还要具备产量高、遗传稳定和容易培养等特点。工程菌既是药物制备过程的微型（生物）反应器，又是参与反应的原材料，因而对于药品质量的影响是显而易见的。要求提交菌种鉴定资料，主要目的是判断菌种的可靠性和特异性，以便从源头上把握产品的质量信息，确保拟定的制备工艺能够始终如一地生产出目标产品。提供的菌种鉴定资料应能准确、全面、特异性地把握其特征，有些申报资料仅提供了菌株的形态特征，难以确定生产菌的种属特征；目前的菌种的分类检定主要依据细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等表型特征,这些方法能对菌种进行初步分类。随着分子生物学的发展,出现了多种对细菌分类、鉴定的DNA 技术,因此，需要提供其形态特征、培养特征、生理生化反应、目标物的胞内胞外含量数据和细胞壁化学组分的研究信息，以确定生产菌的种属，并结合菌种特点，采用DNA技术，提供专属性能特定到“株”的菌种鉴别资料。对于获得微生物次级代谢产物来讲，代谢途径的特异性强，不能保证不同种属或同一种属内不同菌株有同样的生产能力或得到相同的目标物，菌种鉴别应当准确到株。但在具体操作层面可能会存在一些困难，最大问题在于微生物分类学并非成熟的学科，目前对如何分类还存在争议。对工业上应用较广泛的放线菌，目前的研究水平也往往只能鉴定到属或种；16SRNA 基因序列分析作为一种较先进的微生物分类手段，特异性和灵敏度较好，可用于检定生产菌的种属，但不一定适用于同种不同株的生产菌鉴别。国内企业不像国外的企业，很多都没有对自己的生产菌株进行遗传标记，因此菌种鉴别存在困难。但可以结合具体菌株的代谢情况，提供有特异性的分类学证据，菌种鉴别准确到株。
目前申报单位通常的做法是以目标产物的量为生产菌株鉴别的标志，但这种做法存在某种程度上的概念错误。特异地积累某种产物并不能作为菌种分类学的关键性证据，但可以作为考察菌种遗传稳定性的重要指标。因此，在进行菌种鉴别时，应当以微生物分类学为基础，在形态、分子生物学水平进行相应研究，以一系列的特性来标明该菌株异于其它菌株的特征。
对于代谢路径问题，因目前的研究水平一般可以揭示微生物在合成终产品时的代谢路径，且明确代谢路径对控制结构类似物很有帮助，在研究资料中应当提供。但有申请人可能出于保密的考虑，通常不愿意提供，给此类品种的技术评价带来很大困惑，也对产品注册进程产生了不利影响。
3、菌种保藏
微生物菌种在多次传代中会发生遗传性变异，而且多为退化性变异，久置的菌种还会死亡，所以菌种应妥善保藏，使之能长期保持存活、不退化，以便从源头保障产品质量的稳定。菌种保藏条件选择应根据菌种的生理生化特点选择确定，使得菌体的代谢活动处于不活波的状态。保藏时，应首选优良纯种的休眠体（孢子、芽孢等）在一种最有利于其休眠的环境条件（如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等），以降低菌种代谢活动的速度，达到长期保存的目的。一种较好的保藏方法应能较长期的保存原有菌种的优良特性，一般的保藏方法有定期移植保藏法、液体石蜡封藏法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法以及沙土管保藏法和麸皮保藏法等，如何选择，需根据菌种特点和具体条件经筛选研究确定。

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