对多糖类有效部位新药药学研究的建议

审评二部  李计萍

    多糖广泛存在于动物、植物、微生物等有机体中，来源很广。其中研究较早且最多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医药上主要用于疫苗生产。多糖的研究起自20世纪60年代，从20世纪70年代开始逐渐发现多糖及其复合物(蛋白多糖和脂多糖)具有多方面的药理作用，主要包括：增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、增强骨髓造血机能、抗辐射、对肝肾等主要脏器的保护作用等。
    由于多糖多种多样的生物活性以及在保健、疾病治疗领域的广泛使用，使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点。笔者在近年的中药新药审评中遇到了一些以多糖为有效部位的新药，并且发现了一些值得讨论的问题。多糖的质量控制是一个全过程的控制，现就工艺研究、质量控制研究两个方面进行讨论。
    一、 工艺方面：
    现阶段多糖类有效部位新药的申请相对较少，作为新药工业化生产的提取纯化方法还不成熟，以下介绍的一些方法，在多糖研究中虽比较常用，但应用于新药生产中是否可行，尚需深入研究，要结合品种特点及环保等因素综合考虑。
    1、 提取纯化
    多糖的工艺研究一般包括提取、除脂、脱色、除蛋白、醇沉、柱分离纯化、透析等基本步骤。多糖的提取及分离纯化直接影响到成品中多糖的纯度，从而影响到多糖类有效部位的质量控制，最终影响到成品的疗效。
    对多糖的提取纯化方法应根据不同的动、植物来源采用不同的方法进行提取纯化。为保证多糖提取较充分，首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖及微生物细胞内多糖的组织细胞多有脂质包围，一般先加入甲醇或1∶1的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂；含色素较高的根、茎、叶、果实类需进行脱色处理，然后用水、盐或稀碱水在不同温度下提取，应避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂。一般植物多糖提取多采用热水浸提法，所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物。
    在选择提取纯化方法时，应考虑所用方法对不同类别多糖及在大生产条件下的适应情况。如凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。
    对于植物或动物中所含成分可能为糖肽的，应在提取纯化时注意不破坏其结构，并应通过结构分析及含量测定等方法，结合药效学试验，提供研究资料证明其有效部位为糖肽。
    多糖提取液中除去蛋白质是一个很重要的步骤，常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法 三氯乙酸法, 后者较为剧烈，对于含呋喃糖残基的多糖由于连接键不稳定，所以不宜使用。但该法效率较高，操作简便，植物来源的多糖常采用该法。上述三种方法均不适合于糖肽，因为糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。除去蛋白质后，应再透析一次，选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析，可以将不同分子大小的多糖进行分离和纯化，该法用于除去小分子物质十分实用，同时能满足大生产的需要，具有广阔的应用前景。至此，得到的提取液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物。
    对于透析、超滤及超速离心，选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析以及一定条件下的超速离心操作，可按分子大小将多糖样品分级，超滤和透析更常用于除去小分子物质。
    但常用的去蛋白方法、透析、分级沉淀法等纯化方法，大生产时的可行性值得深入研究。
    2、考察指标的选择
    在审评中常见的问题是：仅用多糖或总糖的含量作为考察指标，无法说明提取纯化过程中多糖结构的变化、各多糖之间量的变化以及分子量分布的变化与药效的相关性。如审评的某一多糖类有效部位的新药，在提取分离、灭菌方法的研究中，以酸性多糖和中性多糖的含量、分子量分布情况、灭菌情况为指标，考察工艺过程。经研究发现：提取过程中通过乙醇分级纯化，分子量分布范围缩小。通过比较，高温及活性炭灭菌方法均对多糖含量有影响。后采用加一定浓度的酸进行灭菌，不同酸度，灭菌情况不同。在酸性条件下灭菌时，多糖发生了降解，分子量范围变小。当分子量降到一定范围时药效降低，虽然在整个过程中总多糖含量没有变化，但由于分子量分布发生了变化，导致药效发生了较大的变化。
    因此，在提取纯化过程中应选择合适的考察指标。首先要根据多糖的存在形式及提取部位的不同，决定在提取之前是否做预处理。并且，对提取纯化的关键步骤均应进行成分组成及含量、药效的跟踪，以说明工艺的合理性。
    3、有效部位的确定
    目前，对多糖的研究一般表现为对多糖粗提物的生理活性的研究。多糖提取物的分子量分布较广，在多糖的提取纯化过程中，由于没有对其分子量进行分段，没有进行药效跟踪，没有除去单糖及寡糖等小分子物质，所以常常无法证实有效部位就是多糖。
不同结构的多糖，其药效不同，有的多糖没有明确的药理作用。反之，单糖和寡糖未必没有药理作用。因此，在提取纯化研究中有必要将多糖与单糖、寡糖等小分子物质分开，进行药效比较，说明有效部位所在。
    在有效部位清楚后，需要最大限度地保留有效部位，除去其他成份。为此，要根据有效部位成份和杂质的特点选择适宜的分离纯化方法。
    二、 质量研究方面
    1、 理化性质及多糖的结构分析
    在审评中我们发现，对多糖的理化性质虽有研究，但不系统、不深入。有的仅仅是做一些简单的说明，没有实质性的研究。
    对多糖的理化性质研究是保证多糖质量的重要方面。研究资料显示，多糖的活性与分子量、溶解度、粘度、初级结构和高级结构等性质有关。概括起来，具有生理活性的多糖具备的特性是：①水溶性D－葡聚糖；②具线状结构或尽可能短的分枝；③具有D－螺旋型立体结构，且不被体液中的D－葡聚糖酶水解。有些多糖的一级结构相同，但活性不同，其原因是它们的二级结构和三级结构不同。因此搞清多糖中单糖的组成及立体结构具有重要的意义。  
    由于多糖的活性与分子量、比旋度、溶解度、特性粘度、纯度、初级结构和高级结构等有关，因此应对多糖分子量分布进行研究，对多糖的结构、组成、杂多糖中单糖组成成分进行分析。但对这些性质的研究均需将多糖纯化到一定的纯度如80％以上。所以对于单一多糖组成的新药，则需阐明该多糖中单糖的组成及其摩尔比，说明各组成单糖的连接键型。一般有效部位多糖为杂多糖，则必须阐明该混合多糖有那几种主要多糖组成及各多糖的比例，并说明主要多糖的分子量、组成多糖的单糖的种类及摩尔比。
    多糖的结构分析方法有许多，一般为多糖样品经水解进行单糖的组成分析。
纸层析、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱、X-射线纤维衍射、毛细管电泳法等。
    其中气相色谱法（GC）测定糖类开始于1958年，具有高效、高选择性、高灵敏度、用量少、分析速度快等优点，是多糖结构分析中最重要的手段之一。它与质谱联用可以得出有关单糖残基类型、键的连接方法、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。GC要求试样具有良好的挥发性和热稳定性，多糖本身不能在高温下直接挥发，因而需要将大分子多糖降解为单糖或寡糖，并且将其衍生成具有易挥发、对热稳定的衍生物，进行测定。
    毛细管电泳法（CE）是80年代后期迅速发展起来的一种分离分析技术，它以快速、高效和高灵敏度、所需样品少等特点正被广泛应用。一般多糖经酸或酶水解后进行CE，与标准品对照后计算出各单糖的峰面积进而推算出其单糖组成及其比率。定性分析主要通过进行多糖的指纹图谱来确定糖组成结构的特征。定量分析目前只限于多糖中某特定功能团和组成多糖各单糖的定量分析。
    质谱技术如联动扫陈描、MS/MS方法、不同衍生化处理、同位素标记方法、GC/MC和LC/MC以及各软电离技术的配合使用，质谱法在糖的序列分析和结构鉴定研究中正越来越起着重要作用。
    X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合可以从原子水平对多糖分子结构进行分析。大多数多糖均不能形成单晶，不适用于常规X-射线单晶衍射。而X-射线衍射的另一方式纤维衍射则在这方面展示了越来越大的应用空间，再加上立体化学方面的信息包括键角、键长、构型角和计算机模拟，就可以准确地确定多糖的构型。尽管研究多糖的立体构型有多种方法如电子衍射、旋光测定、核磁共振等，但X-射线纤维衍射与计算机模拟技术相结合仍不失为当前确定多糖立体构型最为有力的工具等。
    2、 分子量分布研究
    在审评中发现，仍有相当一部分多糖类成分的新药研究中没有对多糖的分子量分布进行研究。
    从分子量分布情况，可以反映出多糖组分的纯度。对于杂多糖进行分子量分布进行研究，对控制多糖的质量具有重要的意义。因此有必要提供HPLC法测定多糖分子量及分子量分布的研究资料，并用多糖专用的色谱柱进行分析。
    多糖的分子量分布分析方法较多如蒸气压法、端基法光散射法、粘度法、凝固点下降法、凝胶过滤法、高效液相色谱法、超过滤法等。2005年版中国药典二部中收载了高效液相色谱法，色谱柱为凝胶柱的分子量分布测定法。
    3、鉴别方法研究
    目前，多糖有效部位中药新药的质量标准中，对建立专属较强的鉴别方法研究甚少。多糖定性鉴别方法主要包括溶解性、硫酸咔唑反应(阳性)、蒽酮—硫酸试剂反应(阳性)、苯酚—硫酸试剂反应(阳性)、斐林试剂反应(还原糖试验)、双缩脲试验(阴性)、碘—碘化钾反应(阴性)、茚三酮反应(阴性)、三氯化铁反应、十六烷基三甲基溴化铵络合反应、比旋光度、特性粘度、电导率及PH值等。这些指标专属性不强，无法说明多糖的植物或动物来源。可以考虑通过采用药材对照及分子量分布HPLC凝胶色谱指纹图谱的建立来实现。
    4、 含量测定方法研究
    多糖含量测定方法国内多采用显色试剂-硫酸法，根据单糖、多糖及其衍生物在硫酸作用下水解，脱水生成糖醛类化合物，与酚类、芳胺类等缩合成有色化合物。如苯酚-硫酸法生成橙黄色溶液,在490nm处有特殊吸收，如红毛五加多糖、枸杞子多糖、石斛多糖等。蒽酮-硫酸法生成亮绿色溶液在620nm处有特征吸收，其蒽酮试剂需新鲜配制，如麦冬多糖、黄精多糖等。咔唑-硫酸法用于测定糖醛酸类多糖，如银耳多糖等。
    国外有用LKB柱层析系统，用比旋度、示差折光及紫外检测器，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。
    但以上测定方法应是在工艺中或样品前处理中通过透析或过凝胶柱等方法除去单糖、寡糖及小分子物质的前提下或在质量标准中增加单糖检查项，不得检出单糖的情况下是可行。
    有的新药研究中将中性多糖和酸性多糖的含量相加说明有效成分的量符合有效部位的要求。但两类多糖的测定方法之间有干扰，因此结果的可靠性存在疑问。
    中性糖的测定方法一般采用苯酚硫酸法或硫酸-蒽酮法以葡萄糖或以组成多糖的单糖中含量较高的单糖为对照进行测定；而酸性多糖一般采用硫酸咔唑法或联苯硫酸法以葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸为对照进行测定。中性多糖和酸性多糖往往在多糖提取过程中一并提出，文献报道酸性多糖对中性多糖的含量测定有干扰，而中性多糖对酸性多糖的测定亦有干扰，在确定有效部位总多糖含量时，除应减去单糖或寡糖的含量外，还应考虑酸性多糖和中性多糖两方法之间的相互干扰，并应考察干扰程度，分析是否可以忽略不计，以说明测定方法的可行性。
    三、 小结
    1、目前多糖类有效部位的研究主要存在的问题是工艺研究中，没有进行分子量分布及药效跟踪研究，没有找到真正发挥疗效的有效多糖，说明有效部位为多糖的依据不足。质量控制方面，没有将关键的质控指标列入标准，如分子量分布、单糖检查等。尽管多糖的结构复杂，研究的难度大，并且多糖的结构测定有自身的难度和特殊性，给多糖的研究和临床应用带来了很大的限制。但仍应通过对多糖进行深入的研究，规范多糖的提取方法，说明多糖的构效关系以及多糖的组成与生物活性的相关性，来促进多糖研究的深入。
    2、随着中药分析化学技术的进步和研究方法的不断丰富，在多糖类有效部位新药的研究中，应更多地采用先进的技术手段，以提高多糖类新药的质量控制水平。

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