旋光度/比旋度研究与β－内酰胺类抗生素质量控制的相关性

审评三部蒋煜

摘要：对映体的纯度是手性药物质量控制的重要指标，旋光度/比旋度可反映对映体的光学纯度，是重要的质控指标。本文旨在提请申请人关注，需要根据化合物的结构特点选择质量研究项目，手性药物则应重视对旋光度/比旋度的研究。另外，尽管比旋度/旋光度的测定相对比较简单，但是其测定结果的影响因素较多，因此在实验数据与文献数据存在差异的时候，应该重视这些差异背后隐藏的关于产品质量的信息，考虑这种差异是由试验本身而致，还是由样品的光学纯度不够而致。
关键词：β－内酰胺类抗生素质量研究旋光度/比旋度

一、基本概念
旋光度/比旋度的定义
手性通常可以认为是左手和右手互为镜像不能重合的性质。非手性条件下，对映体的物理性质（如溶解度、熔点，沸点）等基本相同，但是其晶体、液体或溶液能使平面偏振光向不同方向旋转，这种现象称为旋光。最常用的描述对映体组成的术语是光学纯度，指所测定样品的比旋光度与纯旋光体的比旋光度之比。
平面偏振光通过含有某些光学活性化合物的液体或溶液时，使偏振光的平面向左或向右旋转，旋转的度数称为旋光度。偏振光透过长1dm且每1ml中含有旋光性物质1g的溶液，在一定的波长与温度下测定的旋光度称为比旋度。比旋度或旋光度，是反映手性化合物特性及其纯度的主要指标，可用以区别药品、检查纯度或测定制剂的含量。
比旋度：

α－旋光仪所测旋光度，（°）；
L－样品池光程长度，dm；
C－样品浓度，g/100m
D－用于测定光波长为钠黄光D线（波长589nm）
20－测量温度，℃。
光学纯度（%）＝[α]测量值／[α]纯对映体值100%
二、旋光度/比旋度的测定及影响因素
对映异构体的构型与药理作用存在极其紧密的关系。一般而言，在质量标准中对药物立体构型的控制方法包括：比旋度/旋光度，异构体检查等，另外，某些国外药典（如日本药典），常采用核磁共振方法对药物进行结构鉴定。上述各项中，最常见的是采用比旋度/旋光度的方法。
1、旋光度/比旋度测定方法
手性分子都具有旋光性，内消旋化合物无旋光性。中国药典2005年版附录中明确规定，除另有规定外，采用钠光谱的D线（589.3nm）测定旋光度，测定管长度为1dm(如使用其他管长度应进行换算)，测定温度为20℃，使用读数至0.01°并经过检定的旋光计。
2、影响因素
旋光测量是测定对映体组成的传统方法，可以快速反映化合物对映体纯度，但是尚无法十分准确地控制多手性中心化合物的光学纯度，一般而言，旋光度的测定数据受到以下包括样品纯度以及检测方法等多种因素影响。
2.1检测方法
旋光度与偏振光的波长有关，旋光度通常随波长减小而增大，中国药典规定，一般常用的波长为钠光（D线，589.3nm），但是应该注意其前提是“除另有规定外”，即在某些情况这种波长并不合适时，可以选择其他检测波长。
溶剂影响：药物残留溶剂种类和含量的不同，或者用于测量的溶剂种类不同，有可能对测定结果产生明显影响。
溶液浓度：旋光度与旋光性物质溶液浓度之间的关系并非成严格的线性关系，测定供试品旋光度或比旋度时，应严格按照该品种项下的规定浓度测定。
测量温度：[α]λt=[α]λ20-n（t-20），其中n为温度系数，随物质不同而异，[α]λt、[α]λ20分别为t℃、20℃比旋度，一般规定测定温度为20℃。
旋光度与旋光性物质的光程长度成正比，长度指液体或溶液厚度。
同一旋光性物质用不同溶剂、不同pH测定时，由于缔合、溶剂化和解离情况不同而使比旋度变化，甚至改变旋光方向。
2.2样品纯度
对映体杂质，特别是某些大比旋光度杂质往往能显著影响旋光度的测定结果。在测定方法一致的情况下，这是判断药物纯度的一个直观而有效的方法。
三、实例
1、头孢孟多酯钠（Cefamandole Nafate）
头孢孟多是第二代头孢类药物，目前已经收载于英国药典和欧洲药典。日本药典收载了头孢孟多钠，与头孢孟多酯钠相比在7位侧链扁桃酸根上无甲酰基。
日本药典未对头孢孟多钠的比旋度进行控制，英国药典纳入的该原料药为头孢孟多酯钠与碳酸钠的混粉，检测方法和限度为0.1g/ml醋酸盐缓冲液（pH4.7），按照无水和无碳酸钠计算，比旋度为-25°至-33°。
国内多家申请人在申报过程中，发现该样品比旋度明显超过-33°的上限。经过查询，了解到原研发厂所发表文献显示本品在pH5.0左右的醋酸盐缓冲液中的比旋度为-38°±5。进口同品种将其改为在水中测定，限度修订为-35.0°~-42.0°。国内厂家与原生产该品种的意大利厂家、后者与欧洲药典委员会进行了沟通，相关信息显示欧洲药典可能将在后期对比旋度进行修订，目前暂时建议修订为-35°～-42°，但仍需进一步证实中。
在该品种的评价过程中，我们也了解到头孢孟多酯钠旋光度的测定数据受测定时间和样品浓度影响。有研究显示本品在缓冲液中的比旋度随时间而降低，至120min时已经降至-30°左右，提示本品在溶液状态下不稳定。另有研究显示样品用上述缓冲液制成0.1g/ml和0.01g/ml的溶液，测定比旋度有很大差别，提示样品浓度-比旋度线性关系相对比较狭窄。
2、盐酸头孢唑兰（Cefozopran_Hydrochloride）
盐酸头孢唑兰为第四代头孢菌素类抗生素。该品于1995年以Firstcin商品名在日本上市，已经纳入日本药典。日本药典对本品的比旋度控制为采用10%氯化钠:甲醇3:2测定，限度为-73°～-78°。
国内部分申请人在申报本品时，采用日本药典方法，也出现了样品比旋度测定数据与国外药典不相符合甚至差别较大的现象。部分厂家测定的数据即使符合日本药典要求，也多在其最低限（-73°）左右，甚至个别厂家终产品实测样品值仅为-45°左右。在此情况下，如果不对其进行详细的研究和评价，提出令人信服的数据以明确这种差异是与方法相关，还是与样品的纯度有关，则无法进行正确的判断。
3、头孢丙烯（Cefprozil）
头孢丙烯是由顺、反式两种异构体按约9:1的比例所组成的第二代口服头孢菌素。由美国Bristol－Myer Squibb制药公司开发，1992年首先在美国上市，并已经纳入美国药典，未对比旋度进行控制。
最初，国内申请人的研究数据也显示本品在水中的比旋度不尽相同。经过详细考察后，了解到本品在水中溶解度小，且旋光度测定结果很小，较易受测定条件影响，可能是导致产生不同结果的原因，但是，头孢丙烯顺、反异构体比例的差别也可能对测定结果产生较大影响。研究发现本品在不同溶剂中的比旋度也存在一定差异，在0.005mol/L盐酸溶液、甲醇、水，pH7.0磷酸盐缓冲液中的比旋度分别为+27°～+30°、+32°～+35°、+50°～+54°、+38°～+44°。
四、小结
对映体的纯度是手性药物质量控制的重要指标，直接关系药品的安全有效性。旋光度/比旋度可反映对映体的光学纯度，是重要的质控指标。在此也提醒申请人，对原料药进行质量研究时，需要结合产品的结构特征，进行针对性考察。
另一方面，尽管比旋度/旋光度的测定相对比较简单，但是其测定结果受影响因素较多，因此在实验数据与文献数据存在差异的时候，申请人应该重视这些差异背后隐藏的关于产品质量的信息，考虑这种差异是由试验本身而致，还是由样品的光学纯度不够而致。在对存在多个手性中心的原料药进行考察时，建议采用以下研究思路：
1、申报国内外已经上市品种，一般建议参考原发厂家的研究资料以及文献数据进行研究，并且尽可能与上市样品进行比较性试验。
2、申报创新药物，研究过程中则应该严格按照中国药典以及相关试验操作规程的研究，校正仪器，在不同种类溶液、溶液浓度，溶液pH值，检测波长、样品溶液保存时间等条件下进行试验，严格控制测定温度，并尽量与文献数据进行比较。在充分的研究基础之上，选择合适的方法。
3、在充分的研究基础之上，结合安全性数据以及生产的实际情况，制订合理的比旋度范围。

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