注射剂灭菌工艺变更申请常见问题分析

        注射剂变更灭菌工艺为较常见的补充申请，当前的申报资料显示存在如下几种最常见的变更形式：1、由除菌过滤工艺变更为终端灭菌工艺；2、将残存概率法灭菌工艺变更为过度杀灭法灭菌工艺；3、由流通蒸汽灭菌变更为残存概率法或过度杀灭法灭菌工艺。按照《已上市化学药品变更研究的技术指导原则》，上述变更可能对药品安全性、有效性和质量可控性产生较显著的影响，属于Ⅲ类变更，需进行全面的研究和验证工作。
        本文分析了近期灭菌工艺变更申请中的常见问题，并提出了相应建议，供研究者参考。
        问题1：未结合药物的理化性质对灭菌工艺进行全面的研究
        如：对某些稳定性较好，能够耐受过度杀灭法灭菌的品种，申请人仍采用残存概率灭菌工艺。某些对温度比较敏感的品种，部分申报资料仅按照变更后的灭菌条件提供了工艺验证资料，未提供灭菌条件的筛选信息，包括确定F0值的控制范围、降解杂质的控制情况。另外在工艺筛选时，未结合灭菌柜验证的情况考察热点温度对样品的影响。
        建议：目前较多申请人根据《关于发布化学药品注射剂和多组分生化药注射剂基本技术要求的通知》（国食药监注[2008]7号）的要求，对注射剂提出灭菌工艺变更申请。
        申请人可参考欧盟液体产品灭菌决策树，并结合产品的特点设计灭菌条件。选择何种灭菌工艺，首先应取决于被灭菌产品无菌保证水平以及药物的热稳定性，而非其他因素，如包装材料等。只要条件允许，应首选过度杀灭灭菌工艺，主要是因为该工艺的无菌保证安全性非常高，对工艺全过程的控制要求相对较低，只要该药品是严格按照GMP的要求组织生产，即可确保无菌保证值达到≤10^-6，而不必担心装载的生物负荷和耐热性。残存概率灭菌工艺则是从灭菌前微生物污染控制和灭菌过程控制两方面入手，使得灭菌F0值较低的情况下也能确保达到药典规定的无菌保证水平。
        通常情况下，当产品的热稳定无法耐受过度杀灭工艺时，可选择残存概率灭菌工艺，并且通过对处方工艺（包括灭菌工艺）的优化（某些产品可采用加入抗氧剂、工艺中充氮等方式），最大限度地提高产品灭菌F0值，确保无菌保证水平，同时也最大限度地降低药物的热降解。当然，也需注意到，某些产品在提高灭菌温度但缩短灭菌时间后，产生的杂质可能会有所降低。所以，需结合药物的具体情况，考察和评价所选灭菌程序对药物质量的实际影响。
        另外，应该注意到，灭菌柜内不同位置的温度并非完全一致，而是存在一定差异，在对灭菌柜进行验证时需要对冷热点的温差进行控制，如：控制腔室平均温度与冷点温度不超过2.5℃或者最高温度与冷点温度不超过2.5℃等。因此，灭菌柜内不同位置处的F0值存在波动范围。例如：如果选择灭菌条件为121℃，8分钟，腔室最高温度与冷点温度差异2.5℃，在保证冷点F0值为8时，按最大温差计算，热点温度为123.5℃，则热点处的F0值则会远远超出8。在无菌保证满足要求的前提下，上述温差对热稳定产品影响不大，但对热敏感品种则可能产生显著影响。因此，在进行工艺研究时则需关注热点灭菌条件对药物的影响程度，并研究筛选得到产品的F0值适应范围（即，设计空间）；在进行热分布和热穿透等灭菌工艺验证时，需注意热点的F0值应在上述适应范围之内。同时在工艺验证或者抽样检验时，对热敏感产品，也应注意对热点样品进行取样检验。上述研究实际上也体现了质量源于设计（QBD）的理念。
        当前申报资料显示申请人在对某些热敏感药物进行灭菌工艺筛选时，仅针对最终选择的灭菌温度进行了考察，未考察其他温度条件下对产品的影响。
        案例1：某葡萄糖输液，采用115℃30min灭菌条件，文献资料显示灭菌柜内不同部位样品的5-羟甲基糠醛存在较大差异，其中热点处样品的5-羟甲基糠醛超标，提示其灭菌条件筛选或者灭菌柜控制存在缺陷。某申报资料未考察热点对该产品的影响，也未说明工艺验证抽样检验时的取样位置，不清楚是否对热点处样品进行了检验。
        问题2：灭菌工艺验证与工艺研究信息不一致
        如：变更后的灭菌工艺参数（如F0值范围或热穿透试验冷点的F0值）超出灭菌工艺筛选研究的最大F0值，而工艺筛选时显示该最大F0值对产品的稳定性影响显著，无法采用。某些申报资料显示采用残存概率灭菌工艺，但热穿透试验F0值有时能够大于18、19，而稳定性试验样品取样均未说明取样点的F0值情况，所提供资料不能反映灭菌工艺变更的合理性。
        建议：F0值随着时间和温度而累积，而药物的降解也随着时间和温度而累积，这意味着升温和冷却程序的变化可影响杀灭时间，影响产品的稳定性，不当的升温和/或冷却可能会对F0值存在较明显的影响。因此，对于某些热敏感产品，应将升温与降温速率作为重要参数进行控制，使灭菌工艺始终符合设计标准。
        案例2：某维生素类注射剂，原为流通蒸汽灭菌工艺，现申请将灭菌工艺变更为121℃，10分钟，属于残存概率灭菌工艺，工艺研究显示不耐受过度杀灭法。灭菌工艺验证资料显示存在如下问题：1、热点F0值最高大于40，冷点的F0值也大于12，远远超出残存概率的灭菌范围，未考察产品是否可耐受该灭菌条件。2、未抽取热点样品，进行检验。
        问题3：提交的灭菌工艺验证资料不全面
        如：未提供空载热分布的试验数据和结果，或仅提供了最小装载条件的验证数据和结果，未提供满载条件下的试验数据和结果；仅提供一批样品的数据，未提供三次验证的数据以及图谱；验证试验所用热电偶只提供了试验前校验结果，未提供试验后的比对结果；满载热分布试验未提供试验用样品的信息，多规格品种验证不全面，只提供个别规格的试验数据和结果；未说明生物指示剂挑战性试验运行的次数，生物指示剂是否放置冷点处,等。
        建议：空载热分布试验是灭菌设备验证的基础性试验,主要考察设备性能参数，考察灭菌过程中灭菌柜各个不同位置的温差状况，最高温度和最低温度的最大波动数据，冷点、次冷点和热点、次热点的位置，为下一步的满载热试验提供数据支持。同一个灭菌工艺应至少完整地连续运行三次，以证明灭菌设备的均匀性和重现性。
        装载热分布试验方案需根据空载热分布试验的结果制定，考察和确定装载情况下灭菌腔室内温度分布的均匀性，即装载物是否对腔室热分布产生特别影响，导致出现冷点和热点。应至少进行满载条件下的热分布试验。对热分布产生影响的主要原因是产品的数量和物理形状，采用纯水代替某些真实的水溶液产品从风险管理角度是可以接受的，但包装形式应与验证品种包装形式相同，多个规格的品种可采用括号法以合理减少试验运行次数，即选择最小规格和最大规格的产品进行试验。应至少连续运行三次完整的灭菌程序。本试验发现的冷点或热点为热穿透试验需要重点考察的位置。
        案例3：某产品的提交的灭菌工艺验证资料不全面，未提供空载热分布试验资料。本品热分布和热穿透试验为最小装载，未提供灭菌釜的生产能力，未进行满载条件下热分布和热穿透试验，未进行冷点和热点的考察和确定。
        问题4：热穿透试验
        如：热穿透试验未考虑品种、规格、装载方式和数量，或用其他品种、规格、包装形式代替所申报品种，未提供数据支持替代样品与申报品种热穿透无差异性。热穿透试验的温度探头放置位置不符合要求，未进行容器冷点的确定。
        建议：应根据满载热分布试验的结果制定热穿透试验方案。热穿透试验的目的是获取灭菌柜内不同位置的样品在灭菌过程中实际达到的温度和F₀值，从而获取不同位置的样品之间的温度和F₀值数据，并且掌握样品内的温度和F₀值与日常生产运行时灭菌设备记录的温度和F₀值之间的差异。
        由于不同品种以及包装容器的热穿透性存在差异，热穿透试验一般应采用拟申报的品种进行，并明确样品的批号、批量和装载方式。如满载热分布试验中发现有冷点或热点，通常应重点采集该位置的热穿透数据。
        在热穿透试验中，温度探头应插入待灭菌产品中，插有温度探头的样品的放置位置应包括热分布试验确定的冷点和热点。热穿透试验还需关注温度探头的安放方式，灭菌过程的最大F0值、最小F0值、平均F0值等。
        容器中冷点的确定，容器的冷点是灭菌过程中灌封液体容器中最低F0 的部位。采用冷点建立灭菌程序的方法是一个比较保守的方法，因为它假设容器中所有的微生物都聚集在冷点，且冷点位置的温度下灭菌。在热穿透试验之前，首先需要进行容器的测绘，目的是测定灌入液体的容器中最冷点。对于大容量注射剂，冷点位于产品几何中心和纵轴的底部，此冷点需要确认。在小容量注射剂，冷点的定位并不典型，因为溶液升温的速率几乎与灭菌器相同。冷点的位置也受容器方位的影响。当容器旋转或摇摆时，可能找不到可辨别的冷点。
        作为小容量注射液，如有充分的依据，其热分布和热穿透可同时进行。
        案例4：某申请人同时申报了十来个不同产品的注射剂变更灭菌工艺，但申报资料均采用了其中一个产品的热穿透试验，未提供数据证实替代样品与申报品种的热穿透性无差异。
        问题5：灭菌前药液的微生物限度控制要求
        采用残存概率灭菌工艺时，未对灭菌前药液进行微生物限度控制，未考察污染微生物的耐热性。或建立了微生物限度控制标准，但检查的方法不规范，或者未将此标准作为最差条件进行微生物挑战性试验。
        建议：对残存概率灭菌工艺而言，产品灭菌前污染微生物量及污染微生物的耐热性是确定灭菌工艺是否保证足够无菌保证水平的关键因素。应制定微生物中间控制标准，包括灭菌前微生物的污染量和污染菌耐热性标准，灭菌前样品的取样应涵盖整个生产灌装的过程，包括灌装开始、中间和结束阶段，同时应注意所抽样品应与待灭菌样品在同样的条件下进行存放。
        按照目前的技术要求，对于采用终端灭菌工艺的产品，如采用过度杀灭灭菌法，在验证工作中应该重点关注热分布和热穿透的考察，如采用残存概率灭菌法，除了考察热分布和热穿透以外，还应该关注微生物挑战试验和灭菌前微生物负荷的控制。
        问题6：微生物挑战性试验
        如：抗生素、含抑菌剂的品种未考虑品种的抑菌性而直接接种于品种中进行微生物挑战性试验。
        建议：微生物挑战试验的形式通常为将生物指示剂定量加入产品中，制备成带有确定数量微生物孢子的受试产品，将产品安放在灭菌设备内的特定位置，以尽可能低的灭菌参数（接近拟定的灭菌参数的低限）运行灭菌程序，对受试产品进行无菌检查，通过计算确定受一定程度微生物污染的产品经灭菌后微生物的残存概率。为了对液体装载的生物指示剂进行确认，在密封的、灌封液体的容器和密封件上要接种适当的生物指示剂（BI）。液体介质可以是产品或适当的代用品。如果液体产品含有防腐剂或其他抗生素成分，它们有抑制微生物生长的作用，可能有必要用液体替代品作为悬浮剂。使用何种产品作为悬浮剂需要有试验数据的支持，证明它们不抑制微生物的生长。
        应明确微生物挑战试验所采用的生物指示剂的来源、种类、规格（D值与菌数量）、试验结果，应说明试验中所采用的生物指示剂的耐热性及数量对灭菌工艺是否构成必要的挑战。生物指示剂的耐热性应大于生产环境和产品中常见污染菌的耐热性。应根据热穿透试验的结果设计试验方案。若热穿透试验证明不同位置的产品间、不同装载量间、不同装量规格间的热穿透特性有显著差异，应至少选择灭菌F₀值最低的位置、装载量和装量规格（即最差条件）进行微生物挑战试验。
        案例5：某复方电解质葡萄糖注射液变更灭菌条件，工艺验证时未说明生物指示剂挑战性试验运行的次数，生物指示剂是否放置冷点处。
        问题7：质量研究和质量标准
        如：未关注同品种或同类品种国内外质控要求的进展。
        建议：变更灭菌条件多数情况下使药物面临更苛刻的环境，可能导致杂质增加、颜色加深等。另一方面，随着生产条件以及质控要求的提高，国内外药典对某些产品的质量标准也有所提高，需关注同品种或同类品种国内外质控要求的进展，同时应结合相关指导原则，完善对产品的质控要求。
        案例6：某乳酸左氧氟沙星注射液补充申请变更灭菌工艺，由于上市较早，原注册标准对有关物质控制相对简单。国内外现行版药典中与氧氟沙星以及左氧氟沙星相关的品种对杂质控制要求进行了提高，制订了多种已知杂质、其他杂质和总杂质的限度。应对国内外药典中左氧氟沙星有关物质方法进行比较，并按杂质指导原则的要求，在有关物质检查项对结构已知的特定杂质、结构未知的特定杂质、非特定杂质以及总杂质进行分别控制。
        问题8：稳定性试验
        如：稳定性试验未对关键指标，如有关物质进行考察，或在申报资料中未提供具体数据，不能充分反映变更前后样品的质量和稳定性变化情况，不能支持工艺变更的合理性以及灭菌工艺控制的可靠性。
        建议：作为提高灭菌温度的补充申请，建议选取在热点灭菌的产品进行稳定性考察。设置稳定性研究考察项目时，需选择能灵敏反应产品质量变化的检查项目，如：含量、pH值、颜色、有关物质、无菌等检查项目。
        问题9：未关注灭菌温度对包装容器的影响
        如：变更灭菌条件后未关注塑料包装是否可耐受新的灭菌条件。
        建议：应该注意到，对药品来说，包装应具备以下四种特性：保护作用、相容性、安全性与功能性。当前申请人多仅关注了相容性，而忽视了其他特性。某些塑料包装无法耐受115℃或121℃的灭菌条件，在变更灭菌条件后，需关注包装材料是否可满足新的灭菌条件。
        案例7：某碳酸氢钠注射液，变更灭菌条件，采用玻璃包装，未进行相容性试验。美国药典同品种已明确优先选择中性玻璃，且美国同品种的玻璃容器均为中性玻璃，但是近期也因玻璃质量问题出现两起召回事件，均为部分药瓶内含有颗粒物。因此即使采用中性玻璃，仍应进行药液与玻璃的相容性试验。
        案例8：某注射液变更灭菌条件后采用121℃±1℃、15分钟灭菌，但所用塑料包材的适应性温度为115℃30分钟，二者不相吻合。
        问题10：其他
        应该注意到，《已上市化学药品变更研究的技术指导原则》还列举了其他几种Ⅲ类变更形式：包括：①用不同操作原理的灭菌柜替代原灭菌柜。②变更灭菌柜的药品装载量和装载方式，且超出原验证的范畴。③变更除菌过滤过程的滤材种类或孔径。④使用不同容量的冻干设备替代原冻干设备，或增加不同容量的冻干设备，新的冻干设备与原冻干设备的操作参数和总的生产时间有改变。上述变更同样可能对药品安全性、有效性和质量可控性产生较显著的影响，需进行全面的研究和验证工作。