治疗用单链寡核苷酸药物的非临床研究评价概述

治疗用单链寡核苷酸药物的非临床研究评价概述
                                                   余珊珊、胡晓敏、王海学、王旸、王庆利
                                    （国家食品药品监督管理总局药品审评中心，北京 100038）
       [摘要] 单链寡核苷酸（Single-stranded oligonucleotide, SSO）是一种人工合成寡核苷酸，可按碱基互补配对原则主要通过与靶RNA杂交，诱导断裂、调节剪切、抑制翻译等作用抑制靶RNA功能，在基因层面具有潜在的治疗作用。但未经修饰的SSO易被核酸酶降解，经化学修饰的SSO（如经锁核酸修饰后的SSO）其稳定性、杂交亲和力和酶切效率大大提高，成药性显著增强。目前，已有4个治疗用SSO药物在美国或欧洲上市，更多的候选药物处于研发阶段。本文将从上市监管、非临床特点、非临床安全性试验一般原则等方面阐述治疗用SSO药物的非临床研究评价要点。
       [关键词] 治疗用单链寡核苷酸药物，锁核酸，非临床研究评价
       一、概述
       1、单链寡核苷酸和锁核酸
       治疗用寡核苷酸类药物是当今快速发展的药物研发领域，按治疗机制可分为反义寡核苷酸(ASO，Antisense oligonuclitide)、核酶(ribozyme)/脱氧核酶(DNAzyme、deoxyribzyme)、小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）、microRNA等等^[96]_。 
       单链寡核苷酸（Single-stranded oligonucleotide, SSO）是人工合成寡核苷酸，长度通常12~25个单位，分子量在5000~7000D范围内，按碱基互补配对原则与细胞内核酸(主要是RNA)杂交，通过诱导靶RNA降解、抑制翻译、调节剪切等作用调节内源性mRNA的功能，使靶RNA功能丧失。单链寡核苷酸与双链的siRNA在理化性质方面有较大差异。
       未经修饰的单链寡核苷酸易被核酸酶降解，缺乏酶活性, 不能破坏靶基因, 仅起到基因封条的作用，不具备成药性。于是人们采用化学修饰方法改善其稳定性。如采用硫原子取代磷酸骨架上的非成键氧原子，或对寡核苷酸进行糖修饰，使成药性显著提高。
       锁核酸（LNA，Locked Nucleic Acid）是经化学修饰后得到的一种特殊的双环状核苷酸衍生物, 是含有一个或多个2′-O , 4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖的核酸单体, 其核糖的2′-O 和4′-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形。这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内的N结构，降低了磷酸盐骨架局部结构的柔韧性, 增强了稳定性。LNA和DNA/RNA有相同的磷酸盐骨架,其寡核苷酸链可用DNA自动合成仪合成，通过糖环上携带不同的碱基，得到不同的LNA单体。
       LNA具有杂交亲和力高、反义活性、抗核酸酶以及水溶性好和毒性相对较低的特点。LNA修饰DNAzyme是具有核酶切除RNA能力的反义寡核苷酸，10-23 DNAzyme含有一个保守催化区和两个可变侧翼结合区，当侧翼结合区特异地与靶RNA结合后，催化区在两个结合臂之间酶解消化磷酸二酯键。通过在DNAzyme的两个结合臂上引入一个或几个LNA单体，可增加其与底物的杂交亲和力, 使酶切效率明显提高。
       单链寡核苷酸和锁核酸由于具备了以上生物学特性，因而具有在基因水平产生药理作用的潜能。目前已有4个单链寡核苷酸药物批准上市，更多处于研发阶段。本文将从的上市监管、非临床特点、非临床安全性试验一般原则等方面阐述单链寡核苷酸药物的非临床研究评价要点。
       2、上市药物情况
       目前，已有4个单链寡核苷酸药物在美国或欧洲批准上市。
       FDA 于1998年批准第一个反义药物--福米韦生 (fomivirsen)上市。福米韦生由21个硫代脱氧核苷酸组成，通过对人类巨细胞病毒(CMV) mRNA 的转录抑制发挥特异性的抗病毒作用, 玻璃体内注射用于治疗艾滋病并发CMV视网膜炎。常见不良反应有眼内压升高和轻中度前后房炎症反应，未见明显全身毒性。出于商业考虑，该药于2002年和2006年先后在欧盟和美国撤市，主要原因可能是市场过于狭小。
       第二代寡核苷酸药物米泊美生(mipomersen)由法国赛诺菲旗下的健赞公司开发，用于治疗遗传性胆固醇代谢紊乱。于2013年1月由FDA 批准上市，商品名Kynamro，在欧洲未获得上市批准^[1]。米泊美生为每周1次，皮下注射给药，单药或与其他降脂药物合用，用于治疗罕病纯合子家族性高胆固醇血症( HoFH) 。米泊美生是硫代磷酸寡核苷酸钠盐，通过与编码载脂蛋白B-100的mRNA 杂交导致其降解，从而抑制载脂蛋白B-100在肝脏的转录合成。米泊美生的主要毒性是肝毒性，可引起ALT、AST 升高和肝脏脂肪变性，FDA说明书提出了严重肝毒性的黑框警告。米泊美生还可能引起流感样症状、注射部位刺激性等不良反应。
       2016年9月，FDA在临床药效证据不充分的情况下，加速批准了SAREPTA THERAPS公司的eteplirsen有条件上市，该药静脉注射治疗杜氏进行性肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD），通过结合肌营养不良蛋白(dystrophin)基因外显子51的前体mRNA（pre-mRNA），诱导患者突变的exon跳跃。另一个用于DMD治疗的Drisapersen由GSK和Prosensa研发。在III期临床试验（DMD114044）中，Drisapersen组和安慰剂组的主要药效终点指标（6分钟步行距离）和其他次要终点指标未见显着差异，由于药效未达预期而终止开发。其临床常见不良反应主要包括注射局部刺激性和肾功能损伤。
       2016年12月，FDA批准Biogen IDEC公司的Nusinersen（Spinraza）上市，鞘内注射治疗罕见遗传病-儿童和成人的脊髓性肌萎缩（SMA）。SMA患者染色体5q臂上的基因突变，导致运动神经元生存（Survival of motor neuron，SMN）蛋白缺失。nusinersen可结合SMN转录外显子7下游内含子中的一段特定序列，增加SMN2基因mRNA转录包涵的外显子7，增加完整长度SMN蛋白的表达。
       3、监管和技术指导原则
       单链寡核苷酸是化学合成药物，虽然具备生物制品的属性，但按新化学实体进行监管。目前尚无专门针对单链寡核苷酸药物研究的技术指南。ICH S6指导原则适用对象是生物制品，但同时“可能也适用于寡核苷酸类药物”^[2]。迄今唯一的专门论述反义寡核苷酸监管的文件是CHMP 2005年发表的有关其遗传毒性潜在作用评估的回顾报告^[3]，该报告指出硫代磷酸寡核苷酸及其降解代谢物通过掺入新合成DNA造成遗传毒性的可能性小，但理论上存在通过形成DNA三股螺旋诱导基因突变的可能性。
       二、非临床特征
       1、药学特点简述
       单链寡核苷酸是带有多个负电荷的水溶性物质，极性较大，通常采用固相合成制备。单个核苷酸通过5’和3’两个羟基与磷酸二酯连接，将单个核苷酸选择性地脱去5’上保护基团后与原寡链相连接，然后脱去3`上羟基，磷酸酯化后与下一个核苷酸连接。如此循环合成至所需长度，再从固相上切除纯化。
       单链寡核苷酸的总杂质水平约5-15%，大多数杂质属于与活性成分密切相关的有关物质，如缺失1个或多1个（n-1或n+1）的寡核苷酸序列，具有相似的生物活性。由于极性较大，通常采用离子交换色谱法纯化，但其性质导致其与主峰难以有效分离。单链寡核苷酸粗品中其他杂质还可能包括四氮唑、三氟醋酸等合成试剂。从临床前至临床阶段，单链寡核苷酸API质量控制策略是逐步降低杂质水平，粗品经纯化后核苷酸纯度可从80-85%增加至90-95%。
       2、药效学特点简述
       寡核苷酸调控靶RNA功能直至蛋白表达水平的改变具有剂量-浓度-时间依赖性，药效发生取决于药物从血浆房室分布至胞内靶mRNA所需时间及下游信号转导的过程。与血浆分布相比，单链寡核苷酸分布至胞内所需时间长，其作用机制决定了起效较慢，因此PD应答与药物浓度之间通常有一段滞后。因此对药效终点的观察通常采用效应房室模型或间接效应。
       3、安全性特点
       单链寡核苷酸具有适配体（aptamer）特性，可与核酸、多肽、蛋白质等有机分子发生高亲和力、高特异性的结合，类似抗原-抗体结合反应，其药理作用与生物大分子更为接近。单链寡核苷酸的多种毒性与其适体作用有关^[4,5,6]。单链寡核苷酸可通过细胞内吞迅速在肝、肾和网状内皮系统中分布，已知由脱靶杂交引起的毒性主要包括肝肾毒性、血液毒性和免疫刺激等。
       （1）肝肾毒性
       单链寡核苷酸半衰期长，肝和肾等组织中蓄积明显。当靶组织为肝肾以外组织，单链寡核苷酸可与非靶部位的细胞膜、溶酶体、胞质或和核蛋白杂交，引起脱靶毒性，尤其是肝毒性和肾毒性。
       （2）血液系统毒性
       单链寡核苷酸带负电荷，可与血细胞蛋白质上的阳离子部位结合，造成血小板减少，或通过抑制外源性凝血途径因子X酶复合物(Tenase complex) 延长凝血时间。单链寡核苷酸也可直接激活血液中补体旁路途径的补体因子H，激活补体系统，造成血液动力学改变，产生潜在的心血管系统毒性。猴补体因子H对单链寡核苷酸的敏感性高于人类^{[14,15,16 ]}。
       （3） 免疫刺激
       天然免疫系统通过Toll样受体（TLR）等模式识别受体（PRR）识别保守的病原相关分子（PAMP），激活早期免疫反应。细菌和病毒核酸可活化PRR，诱导细胞因子生成。由于寡核苷酸化学修饰的特定序列（例如两侧为2个5"嘌呤和2个3"嘧啶的CpG二聚体）与细菌DNA极为相似，可被PRR识别，从而活化B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，引起杂交非依赖性效应^{[7,8,9,10,11,12,13]}，促进炎性细胞因子分泌。单链寡核苷酸对啮齿类动物的免疫毒性主要包括多器官（包括肝）淋巴组织细胞浸润、肝脾重量增加和淋巴增生；NHP的常见免疫毒性包括皮下给药局部刺激、淋巴增生、脾重增加、细胞因子或趋化因子一过性升高。NHP对PRR相关免疫刺激敏感性较低，与临床相关性更好。啮齿类动物可能过度预测炎症反应 ^[17]。此外，由于单链寡核苷酸在靶组织蓄积，其药理作用放大也可能导致毒性。在研发早期可采用人免疫细胞开展免疫刺激效应全血测定，对单链寡核苷酸的免疫刺激和补体活化相关毒性进行早期常规筛查。
       4、免疫原性
       单链寡核苷酸具有免疫原性^[18]。目前已检测到针对不同单链寡核苷酸的交叉反应抗体。在米泊美生临床研究中，32~60%的患者体内检出ADA，但对药效的影响不明确^[19]。Drisapersen临床连续48周皮下注射给药，29%患者在3~6个月出现ADA，未观察到对PK/PD和安全性的显著影响^[20]。
       5、药代动力学
       目前，单链寡核苷酸非临床和临床最灵敏的检测方法为杂交酶联免疫吸附法（hELISA）^[21]，常用于药物原形的定量检测。LC-MS/MS 也可用于核酸定量测定 ^[22,23] ，灵敏度相对较低，主要用于对分解代谢物如5"和3"端n-1、n-2、n-3等寡核苷酸链的鉴定^[24,25]。此类代谢物是否保留药理活性或毒性取决于其序列和相对量。放射性标记法（如氚标）已也成功用于单链寡核苷酸的组织分布研究^[25]。
       （1）单链寡核苷酸药代动力学总体特征
       ADME
       目前主要采用胃肠外给药，皮下注射途径取代静脉给药。单链寡核苷酸经口给药吸收仅有1~10%，皮下注射给药的绝对生物利用度高于90%。修饰后的寡核苷酸药物通常组织半衰期较长，可达2~6周，其药理作用--抑制靶mRNA表达--持续时间更长，可能带来安全性风险。
       非偶联单链寡核苷酸具有比较一致的组织分布特征，主要分布在肾小管、肝、淋巴组织、皮肤^{[29,30,31,32]}，在其他组织中的分布均在μg/g水平。不同单链寡核苷酸的血浆蛋白结合率差异会导致肾蓄积的差异，血浆蛋白结合率低，则肾蓄积高^[33]。静脉途径给予单链寡核苷酸极少在中枢神经系统分布。单链寡核苷酸是否透过胎盘屏障尚不明确。
       寡核苷酸主要通过组织和血浆内广泛存在的核酸酶代谢^{[34,35,36,37,38,39]}，血浆中主要依靠核酸外切酶（尤其是3"-外切酶活性），细胞内主要依靠核酸内切酶 ^[40,41]。代谢速度主要取决于化学结构的稳定性，LNA修饰寡核苷酸对核酸酶表现出极高的稳定性，代谢较慢。
       寡核苷酸最终以原形或小片段形式主要经肾排泄。修饰的寡核苷酸在高等动物体内半衰期可长达数周，至数月方完全清除^[33]。因为消除半衰期过长，阻碍了采用常规手段开展物质平衡研究，故其清除机制尚不明确。有文献显示，修饰的单链寡核苷酸在给药一个月后的尿和粪中的回收率只有50% ^[23]，体内剩余药物主要以原形存在。
       血浆和细胞蛋白结合率
       单链寡核苷酸静脉或皮下注射给药后，可与血浆蛋白结合，但在红细胞内分布情况尚不明确^[26,27,28]。硫代磷酸寡核苷酸与大鼠、非人灵长类（NHP）和人血浆蛋白结合率可达90~99%，小鼠为80~85%，血浆蛋白结合率高，肾清除率降低^[25]。
       细胞色素P450代谢
       单链寡核苷酸不是细胞色素P450酶的底物^[42,25]，预计不会与依赖氧化代谢途径清除的小分子药物产生相互作用。目前尚无寡核苷酸-药物相互作用的报道^[23,24]。单链寡核苷酸与9种主要药物转运体之间未见相互作用^[45,46]。
       IFN-a、IL-6等细胞因子可调控某些CYP酶系的表达水平，当开发靶向上述细胞因子的寡核苷酸时，应关注靶药理作用对CYP酶系统的影响，以及延伸的对联合用药代谢的潜在影响。
       胞内摄取和转运
       单链寡核苷酸可通过胞吞作用被细胞摄取^{[47,48,49,50,51]}，进入胞内的大部分药物经吞噬作用进入溶酶体，仅少部分经释放、或被胞质和/或细胞核摄取，最终到达靶RNA ^[52]。药物从血浆分布至细胞内靶点较慢，通常需24-48小时^[53]，发挥药理作用时的靶组织药物浓度通常在nM-μM范围内。 
       药物-药物相互作用
       如预期药理作用不影响小分子药物代谢酶系，单链寡核苷酸引起药物相互作用的可能性小。
       （2）LNA药代特征
       LNA皮下注射给药后吸收迅速，Tmax为1~3小时，吸收后分布相可持续48小时，分布过程中血药浓度大幅降低（降幅达2-3个数量级），组织分布远大于血浆分布。消除半衰期长，消除相血浆暴露仅占总暴露的极小部分。LNA主要分布于肾和肝脏，因此药代研究除血浆外还应考察药物的组织分布。由于血浆浓度低，对检测方法的灵敏度要求较高，通常选用灵敏度较高的杂交ELISA法。此外，还需建立生物分析方法用于组织药物浓度测定。
       三、非临床安全性试验的一般原则
       1、动物种属的选择
       单链寡核苷酸产品的安全性试验通常要求啮齿类和非啮齿类两个动物种属，常用小鼠（或大鼠）和非人灵长类（NHP）^[54]，犬和小型猪可作为非啮齿类动物的替代，但应至少有一个相关动物种属。目前已获得的单链寡核苷酸安全性数据主要来源于NHP。有研究显示，啮齿类动物对单链寡核苷酸的免疫刺激反应敏感性高于NHP，可能导致炎症相关的非特异性肿瘤 ^[19]。
       当单抗类药物缺乏相关动物种属时，由于其毒性往往来源于其药理作用延伸和免疫原性，可采用“动物源性同源类似物”开展替代研究。而单链寡核苷酸的毒性往往和药理作用无关，可考虑采用人源化小鼠模型。应慎重使用动物源性同源寡核苷酸类似物进行替代研究，原因如下：
       ① 寡核苷酸微小的序列和模式差异可能导致毒性的巨大改变^[55]。
       ② 替代研究通常采用的啮齿类动物具有种属特异性毒性，与人体相关性有限。
       ③ 可能需要额外的CMC研究。
       2、给药途径
       安全性试验通常采用临床给药途径。历史数据显示，单链寡核苷酸药物皮下给药基本可达到全身暴露，生物利用度较高。也可用采用玻璃体内注射、经口、吸入、直肠内、鞘内、脑室内、瘤内、药物洗脱支架等局部给药方式^[56]。
       单链寡核苷酸经口给药后个体吸收变异大，在渗透促进剂作用下吸收率仅10~14%，在酸性环境下易降解。由于小鼠的胃转运时间短，经口给药后大部分药物可到达小肠，因此经口途径给药可考虑小鼠模型。若拟用NHP经口给药，应考虑开发抗酸剂型^[57,58]或采用空肠给药。
       3、给药方案
       单链寡核苷酸到达体内稳态浓度较慢，重复给药毒性试验给药方案应使给药结束时的血药浓度至少达到90%稳态浓度。给药可采用每周1次或负荷给药（给药初期采取高给药频率或高剂量水平） ^[59,60]，各给药方案的优缺点见表1。给药周期可主要参照ICH M3（R2）指导原则的要求，应能支持拟开展临床试验。考虑到单链寡核苷酸半衰期长，应设置足够长的恢复期（理想情况下至少8周）以暴露长期给药后的迟发毒性以及观察恢复情况。
       表1  两种给药方案优缺点比较

       四、 非临床试验的项目选择和重点关注问题
       1、安全药理学
       单链寡核苷酸组织分布迅速，系统毒性相对小分子药物较低。由于其药理作用接近生物大分子，可参照生物大分子，根据实际情况在重复给药毒性试验中伴随开展安全药理学试验 ^[61]。
       （1） 对心血管系统的影响
       单链寡核苷酸可能引起补体系统活化导致血液动力学改变，产生急性心血管系统毒性^{[62, 63]}。心血管安全性试验可采用非啮齿类动物^[64]，硫代磷酸寡核苷酸建议首选NHP ^[65,66]，不含硫代磷酸骨架的寡核苷酸可用小型猪或犬替代猴研究补体的影响^[64]。目前对不同单链寡核苷酸心血管研究的动物种属选择尚未形成共识。
       建议根据心血管风险程度和作用靶点选择合适的试验方案。例如，皮下注射引起补体活化风险较低，可结合重复给药毒性试验开展对心血管系统评估；静脉给药时药物血浆半衰期短（1~2h）、Tmax短，预期给药后数小时内即可能引起补体活化，应根据实际情况考虑开展心血管系统遥测；若作用靶点位于心脏组织或血管，预期有长期药理作用，应关注非啮齿类动物给药对心血管指标的长期影响，以及补体活化诱导的潜在血压变化。 
       单链寡核苷酸分子量大，直接作用于hERG通道可能性很小。如果非啮齿类动物体内试验未提示ECG参数异常，通常不需单独开展对hERG通道影响的体外试验。
       但在下列情况下，仍建议开展hERG通道试验：体内试验已观察到给药对非啮齿类动物校正QT间期的影响；药物有心脏蓄积；已知化学结构修饰容易产生对QT间期的影响。
       （2） 对中枢神经系统的影响
       对无修饰单链寡核苷酸，可在重复给药毒性试验中增加中枢和外周神经系统检查；对于经修饰的单链寡核苷酸，或以鞘内注射等预计在 CNS中暴露量高的方式给药，除在重复给药毒性试验中评估对中枢神经系统的长期影响外，建议独立开展对神经行为影响的安全药理试验。目前尚不明确单链寡核苷酸是否能透过血脑屏障。
       （3） 对呼吸系统的影响
       单链寡核苷酸非经口给药引起呼吸系统毒性风险较低。评估呼吸系统安全性时，ICH S7A建议测量呼吸频率和至少另一个呼吸参数（仅检测呼吸频率是不够的，建议同时测量潮气量，以计算每分钟通气量）。若单链寡核苷酸靶向呼吸系统，建议开展专门的呼吸系统安全药理研究。
       （4） 安全药理补充试验
       肾：单链寡核苷酸主要通过肾排泄，重复给药可能导致药物蓄积在肾近端小管细胞内溶酶体，因此有必要对肾功能相关参数进行详细检查，可结合重复给药毒性试验开展。
       消化系统：单链寡核苷酸胃肠外给药很少导致消化系统不良反应，通常不要求开展独立的消化功能研究，可结合重复给药毒性试验监测相关指标。 
       2、单次给药毒性
       急性毒性主要和单链寡核苷酸与血浆蛋白之间的适体作用有关。
       单链寡核苷酸引起一过性补体活化和凝血时间延长的血浆浓度阈值约为50~70μg/ml ^[67]，作用可能随核酸序列缩短或硫化负荷降低而降低^[68]。
       凝血时间延长，尤其是静脉快速推注后的凝血时间延长，可能与抑制外源性凝血途径因子X酶复合物(Tenase complex)有关，抑制程度与Cmax正相关，凝血异常可随血药浓度降低在数小时内恢复。采用皮下注射给药途径或慢速静脉滴注给药可降低相关风险。
       单链寡核苷酸可通过结合抑制性因子H激活补体旁路。猴快速输液给予硫代单链寡核苷酸后可出现补体活化，进而引起血液动力学改变，导致过敏性休克伴心血管性虚脱 ^[62,69,63]。人体补体活化风险低于NHP，临床试验中尚未观察到上述不良反应 ^[70,71,72]。
       3、重复给药毒性
       重复给药毒性主要与单链寡核苷酸在组织蓄积有关。单链寡核苷酸主要蓄积在肾皮质和肝组织，因此肾和肝是主要毒性靶器官，未见对脑、骨骼肌、睾丸等组织毒性的报道^[73]。除安全性指标外，重复给药毒性试验应考察药效终点指标，证实受试物能在靶组织中与靶mRNA结合产生相应的药理学作用。
       （1）肾毒性
       肾是首要的毒性靶器官。非偶联的单链寡核苷酸全身给药后，肾皮质通常是药物浓度最高的组织，药物可在肾近端小管细胞蓄积，产生肾小管毒性^[74] 。雄性大鼠对单链寡核苷酸的肾毒性特别敏感，常见毒性是蛋白尿（与药物刺激导致的慢性进行性肾组织病理学改变有关 ^{[75, 19]}）以及肾组织病理学改变（主要包括近端小管上皮细胞细胞质嗜碱性和/或嗜酸性颗粒浸润，可能与寡核苷酸在吞噬溶酶体蓄积有关^{[76, 67, 77]}）、近端小管一个至多个大胞质囊泡^[78]、肾小管变性伴个别细胞脱落至管腔内、肾小管细胞萎缩以及肾小管再生/弥漫性嗜碱粒细胞增多）。肾毒性程度通常与肾分布浓度有关，经过足够长的恢复期后通常可恢复 ^[59]。在毒理学试验中除关注血清肌酐和尿素等常规肾功能指标外，建议同时关注指示晚期肾损伤的生物标记物，如尿KIM-1^[79]）。
       单链寡核苷酸全身给药，可引起人血肌酐轻度（10~20%）升高。Drisapersen有轻度肾不良事件的临床报道^[80]。某些单链寡核苷酸可能引起严重肾毒性^{[81, 82, 83]}。
       （2） 肝毒性
       肝是单链寡核苷酸高分布的另一个主要器官，尤其是直接靶向肝组织的药物。值得注意的是，在低暴露量水平下也可能出现肝毒性。
       单链寡核苷酸可分布于多种肝细胞 ^[84]，枯否氏细胞和肝实质细胞是主要的靶细胞。啮齿类和NHP最常见的肝组织病理学改变是枯否氏细胞肥大以及胞质嗜酸性/嗜碱性颗粒浸润，肝细胞变性和坏死/凋亡，通常伴血清ALT升高。啮齿类（特别是小鼠）比NHP对肝毒性更为敏感，炎性反应程度更高^[78]，因此与临床人肝毒性的相关性有限。在小鼠2年致癌性试验中，米泊美生在60mg/kg/周（2倍临床暴露量）的剂量水平下可能由于小鼠种属特异性炎症反应诱导雌鼠肝细胞腺瘤和肝细胞癌发生率增加。临床试验中曾有单链寡核苷酸诱导ALT升高的报道 ^[85]。
       单链寡核苷酸肝毒性还可能与某些特殊序列和化学修饰有关。早期研发应使用有效的体外和体内模型进行肝毒性筛查。
       （3）免疫刺激、局部刺激性和血液系统毒性
       单链寡核苷酸可引起免疫刺激相关炎症反应，反应程度与寡核苷酸序列、碱基修饰和骨架化学性质有关。避免单链寡核苷酸结构中出现CpG基序，或加入胞嘧啶甲基化可降低炎症反应风险^[86]。导致NHP出现免疫相关炎症（如血管炎和肾小球肾炎）的原因可能是重复低水平的补体活化^[87]。NHP与啮齿类相比对炎症预测的相关性更好
       炎症相关的血液学异常反应主要包括血清球蛋白升高，白蛋白下降，白细胞计数（尤其是单核细胞和/或嗜中性粒细胞）升高，红系参数和血小板下降，机制尚不明确 ^{[88,67,78,89,90,91,92,93,94,4]}。drisapersen可引起人^[72,4]和NHP^[95,72]重度血小板减少。LNA脱靶也可导致血小板下降，但幅度较小。
       局部给药（例如眼、鞘内、口或直肠给药）可能导致局部刺激性和炎性改变等特殊安全性问题，应注意考察相关指标。总体来说，在毒理学试验中，除考察常规终点指标外，应根据每个单链寡核苷酸毒性特点有针对性的增加安全性终点指标 ^[60]。
       单链寡核苷酸有临床意义的毒性反应多为慢性反应，主要见于实体组织。因此，靶组织药物浓度对预测安全性风险具有重要意义。由于血药谷浓度和肝组织分布之间通常存在稳定相关性，因此血药浓度可在一定程度上预测肝毒性，毒代研究可考虑在每次给药后1周或在下次给药/剖检前采集样本（应尽可能晚），并测量血药谷浓度，评估药物蓄积情况。
       单链寡核苷酸的临床主要不良反应包括注射部位刺激性和寒战、发热或关节痛等全身症状，而动物模型通常不能完全预测注射部位反应。米泊美生临床试验中约50%的患者出现了给药局部反应和流感样症状，是导致给药终止的主要原因。 
       4、遗传毒性
       标准试验组合目前尚未检测到单链寡核苷酸的遗传毒性 ^[96,97,98]，但理论上仍存在遗传毒性可能:①降解出的单核苷酸与基因组DNA整合；②与基因组DNA形成三股螺旋^[3]导致遗传毒性。对于情况②，尽管目前认为大多数单链寡核苷酸形成三股螺旋可能性极小，但如果其序列中存在＞12个碱基的多个嘌呤区，且与人类DNA序列具有同源性，应视具体情况考虑开展遗传毒性试验。
       对于何时需要开展遗传毒性研究的问题，由美国欧洲多国的制药企业、学术团体和监管机构专家组成的寡核苷酸安全性工作组（OSWG）于2016年发表了立场文件^[96]，认为对仅含有自然化学修饰或采用简单水溶性处方，以及包涵一些特定化学修饰（如PS链接，2’-MOE和2’-O-Me糖修饰等）并经反复试验得到一致阴性结果的同类修饰寡核苷酸无需再开展遗传毒性试验。对所有新型单链寡核苷酸化学实体(即包含非天然或尚未证实遗传毒性的新化学实体成分的，例如新偶联物或新链接)或单链寡核苷酸新制剂应开展遗传毒性研究。
       例如，已知多个LNA 修饰的不同单链寡核苷酸药物，遗传毒性试验结果均为阴性，对于有类似LNA修饰的可认为属于“非新型”^[96]，无需开展遗传毒性试验。但当LNA偶联了新的半乳糖胺配体（GalNAc）糖基化修饰时，就有必要开展遗传毒性试验了。单链寡核苷酸药物开展遗传毒性试验的决策可参考图1。
       此外，OSWG认为遗传毒性试验组合选择要求基本遵循ICH S2（R1），除了推荐用体外哺乳动物细胞试验检测大部分非化学修饰的寡核苷酸药物的致基因突变作用，对含有化学修饰的寡核苷酸药物仍开展常规AMES试验。
       图1  开展遗传毒性试验决策路径

       5、生殖毒性
       单链寡核苷酸通常需开展生殖毒性研究，时间和内容主要参照ICH M3（R2）的要求。单链寡核苷酸的骨架、靶药理作用和脱靶作用可均可能造成母体和胚胎-胎仔生殖毒性^[35]。目前，单链寡核苷酸是否可以通过胎盘屏障尚不明确^{[100,101,102]}，由于单链寡核苷酸可以直接作用于胎盘，且在较低的子代暴露时，单链寡核苷酸有引起胚胎-胎仔毒性的风险。
       开展生殖毒性试验前应首先调查靶序列的蛋白表达，以及在胚胎、胎仔、幼年动物体内以及生殖组织中的分布表达情况，估计靶序列蛋白表达抑制对生殖的潜在影响。建议选择相关动物种属进行试验，必须使用NHP时可选择开展ePPND试验。作为替代选择，也可采用小鼠或大鼠源性同源替代物与人源单链寡核苷酸同时开展生殖毒性试验，或者采用人源小鼠模型开展相关研究。给药途径应与临床给药途径一致，给药方案设计需考虑受试药的PK特点。通常单链寡核苷酸在给药后数小时内即从血浆分布至组织内，明显的母体血药浓度仅出现于给药后数小时，因此可将周剂量分成日剂量给药，以确保在子代离乳前关键发育期维持日母体暴露和胎盘暴露。对于拟局部给药的单链寡核苷酸，可按照一般毒理学研究中所确定的暴露量全身给药。
       6、致癌性
       核酸对于啮齿类动物具有广泛的免疫刺激性，诱导全身炎症反应。啮齿类动物终生给予硫化单链寡核苷酸可诱导增生或肿瘤，可能与其促进基质和单核细胞分裂和增殖有关^[67]。米泊美生可诱导小鼠肝细胞腺瘤/肝细胞癌，并在两个动物种属诱导出注射部位肿瘤（纤维瘤/纤维肉瘤/纤维组织细胞瘤）或脾血管肉瘤。因此，除晚期肿瘤适应症外，临床需长期使用的单链寡核苷酸通常需进行致癌性评估。
       7、临床药物毒性预测和安全范围
单链寡核苷酸的动物肾和肝毒性与人体相关性较高，不同的分子间的脱靶毒性也较一致 ^[95]，因此动物毒理试验对预测SSO的临床安全性风险价值较高。2013年DIA/FDA在寡核苷酸会议上提出，首次人体试验剂量通常不依据啮齿类动物数据推算^[103]，主要参考非啮齿类动物的数据 ^[72]。在LNA研发中主要根据NHP的毒理学数据推测首次人体给药剂量。
       8、儿科用药
       如单链寡核苷酸候选药物拟用于儿童适应症或未成年人，须提供幼龄动物安全性试验数据等证据支持^{[104,105,106]}。

       备注：本文的撰写经过了与国内外相关学会和有研发经验企业的研发人员和毒理学家的多次交流，感谢他们对本工作的宝贵建议。
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