欧州药典中两个植物来源药品的质量标准简介

审评二部 付文卫 张永文

    在世界各地使用的药物中约有25%的来源于植物，目前仍有121个活性成分制成的药物广泛地应用于临床。世界卫生组织(WHO)建议的252个基本药物中有11%来源于植物，还有相当数量是以天然产物为前体经合成获得。来源于植物的药物，早期的从洋地黄属（Digitalis spp.）植物中得到的地高辛（digoxin）、从金鸡纳树属（Cinchona spp.）植物中得到的奎宁（quinine）和奎宁定（quinidine），近期的有从长春花（Catharanthus roseus）中分离得到的长春碱（vinblastine）和vincristrine以及从红豆杉中分离得到的紫杉醇等。据估计目前在市场上销售的和处在临床试验的抗癌药和抗感染药物中，大约有60%的是天然来源的。[1][2]
对于来源于天然产物，尤其是植物的药物，研究其质量控制现状和规律对我国中药及天然药物质量控制水平的提高有一定的参考价值。本文仅以欧州药典（EP4）中的两个药物为例，介绍其质量控制的要点，以期对中药及天然药物有效成分新药的质量研究及标准建立有所启发。
1、地高辛（Digoxin）(EP4, 01/2002:0079)
    地高辛为目前临床常用的中等强度强心药，来源于洋地黄属植物。是经分离得到的强心苷类天然产物。欧州药典EP4中其质量标准内容包括以下几个内容：定义（DEFINITION）、性质（CHARACTERS）、鉴别（IDENTIFICATION）、检查（TESTS）、分析（ASSAY）、贮藏（STORAGE）和杂质（IMPURITIES）等几项。
定义（DEFINITION）项规定了地高辛的含量在95～103%之间。
    性质（CHARACTERS）描述了地高辛的外观、性状和常见溶剂中的溶解性。地高辛是白色或类白色的粉未或无色的结晶；几乎不溶于水，溶于甲醇和二氯甲烷1:1(V/V)的混合溶剂中，微溶于乙醇。
    鉴别（IDENTIFICATION）中分为首选鉴别和备选鉴别两类。本品的首选鉴别项是应用红外光谱，通过与标准图谱的对照而鉴别；备选鉴别包括一个TLC鉴别和两个理化鉴别。
    检查（TESTS）项包括澄明度、旋光度、有关物质的检查、干燥失重和硫酸盐灰分检查等内容。检查项在质量标准中所占篇幅最多，澄明度检查中规定本品50mg在10ml甲醇和二氯甲烷混合溶剂中应无色透明；旋光度规定本品0.2g在10ml无水吡啶溶剂中其旋光值应在+10～+13之间；干燥失重规定本品不超过1%；硫酸盐灰分规定本品不超过0.1%。
    有关物质检查是检查项占有篇幅最多的内容。地高辛也称异羟基洋地黄毒苷，其中的杂质洋地黄毒苷和羟基洋地黄毒苷是与地高辛结构相似的强心苷类天然产物，其中洋地黄毒苷也作为强心类药物应用于临床，但其起效时间和作用强度与地高辛并不相同，因而控制其含量限度显得非常重要。
    本品采用TLC法，通过配制不同溶度的对照品溶液，规定其中的杂质洋地黄毒苷（digitoxin）不超过1%，羟基洋地黄毒苷（gitoxin）不超过2%，其它杂质总量不超过2%。其具体操作如下：供试品50mg溶于5ml甲醇和二氯甲烷1:1(V/V)的混合溶剂中配制成10mg/ml浓度。在甲醇和二氯甲烷1:1(V/V)的混合溶剂中配制成五种对照品溶液：(a) 20mg对照品溶于2ml混合溶剂中配成10mg/ml浓度；(b) 1ml (a) 对照品溶液在混合溶剂中稀释至50ml，制成0.2mg/ml浓度；(c) 2ml(b) 对照品溶液在混合溶剂中稀释至4ml，配制成0.1mg/ml浓度；(d) 5mg洋地黄毒苷对照品溶于50ml混合溶剂中配制成0.1mg/ml浓度；(e) 5mg羟基洋地黄毒苷对照品溶于25ml混合溶剂中配制成0.2mg/ml浓度。供试品溶液和对照品溶液各取2μl，通过薄层色谱分离后（色谱条件和操作方法略），对比斑点大小而判别。结果判断：经薄层分离后与对照品溶液(d)比较，供试品色谱相应位置上显示出的斑点小于对照品(d)色谱所显示的斑点（洋地黄毒苷限量不超过1%）；经薄层分离后与对照品溶液(e)比较，供试品色谱相应位置上显示出的斑点小于对照品(e)色谱所显示的斑点（羟基洋地黄毒苷限量不超过2%）；经薄层分离后与对照品溶液(b)和对照品溶液(c)比较，供试品色谱中除主斑点、洋地黄毒苷和羟基洋地黄毒苷斑点外的其它斑点小于对照品(b)色谱所显示的斑点（其它苷类杂质限量不超过2%），同时供试品色谱中除主斑点、洋地黄毒苷和羟基洋地黄毒苷斑点外的其它斑点最多只能有一个大于对照品(b)色谱所显示的斑点（其它苷类单体杂质限量不超过1%）。
    分析（ASSAY）采用比色法在495nm处测定，并通过参比溶液来计算本品的含量。
    贮藏（STORAGE）规定本品避光保存。
    杂质（IMPURITIES）规定了本品的杂质为洋地黄毒苷（digitoxin）和羟基洋地黄毒苷（gitoxin），明确了其化学结构。
2、地奥司明（Diosmin）(EP4, 01/2002:1611)
    地奥司明最早在1925 年从玄参属植物Scrophularia nodosa中被分离，1969年首次作为一个治疗药物使用。在欧州，地奥司明作为血管保护药剂和慢性静脉疾病治疗剂的使用超过已经30年。地奥司明可以是天然来源或从天然产物橙皮苷经半合成方法得到。欧州药典EP4中其质量标准内容包括以下几个内容：定义（DEFINITION）、性质（CHARACTERS）、鉴别（IDENTIFICATION）、检查（TESTS）、分析（ASSAY）、贮藏（STORAGE）和杂质（IMPURITIES）等几项。
    定义（DEFINITION）规定了地奥司明的含量在90－102%之间。
    性质（CHARACTERS）描述了地奥司明的外观、性状和常见溶剂中的溶解性质。地奥司明是灰黄色或浅黄色的吸湿性粉未；几乎不溶于水，溶于DMSO，几乎不溶于乙醇，溶于稀的碱性溶液中。
    鉴别（IDENTIFICATION）：本品的鉴别有两项，第一项为应用红外光谱，通过与标准图谱的对照而鉴别；第二项鉴别为HPLC鉴别，要求供试品溶液色谱保留时间和峰的大小与对照品溶液(a)色谱基本一致。
    检查（TESTS）：根据本品的特点，检查项为碘的限量、相关物质的检查、重金属、水分和硫酸盐灰分等检查项目，是质量标准中所占篇幅最多的内容。本品目前多为橙皮苷经碘脱氢得到，故需要控制碘的限量。本品碘的限量采用电极法，以对照品溶液作对照，要求本品含碘量不超过0.1%。
地奥司明是典型的黄酮类化合物，目前多为橙皮苷经碘脱氢一步而制到。其中的杂质A乙酰基异香草酮（acetoiso- vanillone）是其反应过程中产生的降解产物；杂质B橙皮苷（hesperidin）是未反应完全的起始原料；杂质C（isorhoifin）、杂质E 6-碘地奥司明（6- iododiosmin）和F香叶木素（diosmetin）为合成反应的副产物。液相色谱中杂质B和C的保留时间非常接近。本品相关物质的检查是HPLC法，HPLC法规定了液相色谱的柱的规格、固定相粒径、柱温、流动相组成、流速、检测波长、检测时间，提供了样品及杂质的保留时间。在系统的适用性方面，通过对照品溶液，规定了分离度、杂质限度和检测限。
本品规定的色谱条件是：色谱柱大小0.10m×4.6mm(Ø)，固定相为十八烷基硅胶（粒径3μm），柱温40°C；流动相为乙腈:冰醋酸:甲醇:水(2:6:28:66, V/V/V/V)；流速为1.5ml/min；检测波长275nm；进样用10μl的定量阀；测试时间为地奥司明保留时间的6倍；地奥司明的保留时间约为4.6分钟，相对于地奥司明的保留时间，杂质A为0.5，杂质B为0.6，杂质C为0.8，杂质C为2.2，杂质E为2.6，杂质F为4.5倍的地奥司明保留时间。本品25mg的供试品以二甲基亚砜25ml配成1mg/ml浓度供试品溶液；在二甲基亚砜中配制成三种对照品溶液：(a) 25mg对照品溶于25ml溶剂中配成1mg/ml浓度对照品溶液；(b) 5ml (a) 对照品溶液稀释至100ml，制成0.2mg/ml浓度对照品溶液；(c) 25mg对照品溶于25ml溶剂中配成1mg/ml浓度对照品溶液，对照品溶液(c)仅用于系统适用性实验。
    采用对照品溶液(c)时，杂质B和C的分离度至少要达到2.5。在杂质含量限度的计算方面，除杂质A和F的结构差异较大外，地奥司明与其它杂质结构比较近似。为了计算杂质A和F的含量限度，明确了杂质A的校正因子为0.38，F的校正因子为0.61。本品含量限度规定：供试品溶液的色谱中，杂质A的峰面积小于对照品溶液(b)色谱中主峰面积的0.2倍（杂质A限量不超过1%）；杂质B的峰面积小于对照品溶液(b)色谱中主峰面积（杂质B限量不超过5%）；杂质C的峰面积小于对照品溶液(b)色谱中主峰面积的0.6倍（杂质C限量不超过3%）；杂质E的峰面积小于对照品溶液(b)色谱中主峰面积的0.6倍（杂质E限量不超过3%）；杂质F的峰面积小于对照品溶液(b)色谱中主峰面积的0.6倍（杂质F限量不超过3%）；其它任一杂质的峰面积小于对照品溶液(b)色谱中主峰面积的0.2倍（其它杂质限量不超过1%）；包括杂质A在内的其它杂质的总峰面积小于对照品溶液(b)色谱中主峰面积的0.2倍（包括A在内的其它杂质限量不超过1%）；同时杂质总的峰面积小于对照品溶液(b)色谱中主峰面积的2倍（总杂质限量不超过10%）。    本品的检测限为采用参比溶液(b)时，能检测到0.1%的含量。
    本品规定重金属含量不超过20ppm（检测2.0克样品）；水分含量不过过6%（检测0.3克样品）；硫酸盐灰分规定本品不超过0.2%（检测1.0克样品）。
分析（ASSAY）采用HPLC法，并通过参比溶液(a)来计算本品的含量。
    贮藏（STORAGE）规定本品密封保存。
    杂质（IMPURITIES）规定了本品的杂质A为乙酰基异香草酮（acetoiso- vanillone）、B为橙皮素（hesperidin）、C为（isorhoifin）、E为6-碘地奥司明（6- iododiosmin）和F为香叶木素（diosmetin）。
    从EP4中两个来源于植物的药品标准的情况可见，欧州药典中来源于植物的药品的质量标准有以下几个特点：1、含量范围比较严格，以上两个标准的含量上限最高仅103%；2、杂质要求比格严格，不仅规定了杂质的总量，每个杂质的限量都进行了规定；3、检测结果比较直观，不用作过多的计算，标准中一般需配制一定数量的参比溶液，通过与参比溶液的比较来获得检测结果；4、标准中方法叙述详尽，如地奥司明相关物质检查中对HPLC条件的规定就非常详尽。我们知道源于植物的药品常常会出现结构非常相似的现象，不同的HPLC条件，杂质峰的情况会不完全一样，如果对杂质进行了深入的研究，固定了杂质的检测条件，会更有利于我们对杂质的控制。这些对我们新药的标准制定和审评有一定的参考和借鉴作用。
    本文仅对欧洲药典（EP4）中源于植物的两个药品质量标准进行了简要介绍，希望为我国有效成分新药的质量研究与标准建立提供有益的参考。

参考文献：
1、S.M.K. Rates. Plants as source of drugs. Toxicon. 39 (2001): 603613.
2、Yue-Zhong Shu, 1998. Recent natural products based drug development: a pharmaceutical industry perspective. Journal of Natural Products. 61(1998): 10531071.
3、Council of Europe. European Pharmacopoeia, 4th edition. 67075 Strasbourg Cedex, France. 2001, PP1043～ 4044,1060～1062.