细菌内毒素检查方法以及限度要求浅识

审评三部蒋煜

摘要：由于方法本身的优越性，采用细菌内毒素检查法取代热原法的国内申报资料逐年增加，但部分资料仍存在一定缺陷，本文对该法及其影响因素、质控要点等进行简要评述，以期申请人注意规范对该部分的研究工作。
关键词：细菌内毒素方法学

热原检查法或细菌内毒素检查法是注射制剂的关键质控指标之一。一直以来，热原检查在药物研发中广泛使用，方法比较成熟，目前药典和其他国家标准中有很多品种采用热原检查，但热原检查易受试验动物个体差异，方法灵敏度、药物本身性质（某些药物如乳糖酸红霉素引起降温，青霉素往往也有类似作用，两性霉素B 可引起升温）等影响，使用受到一定限制；细菌内毒素法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，检测供试品中细菌内毒素的限量的方法，由于方法灵敏度高、准确、快速和经济等优点，已在各国药典中得到推广。当然也仍有部分药物因为药物干扰等其他因素无法使用细菌内毒素检查法。上述两种方法目前都是可行的内毒素物质检查方法，在实际应用过程中可以结合药物本身性质进行选择。但在审评中发现，由于细菌内毒素检查法国内研究时间不长，导致部分注册申请人在药物研发时对细菌内毒素检查法的认识上存在一定偏差，本文希望通过对该方法的方法学和限值计算的相关介绍，使研发者增进对细菌内毒素检查法的认识，提高药物研发水平。
关于细菌内毒素的研究方法，中国药典2000年版纳入的细菌内毒素检查法为凝胶法（附录XI E），在细菌内毒素检查应用指导原则中（附录XIX F）提出了浊度法和显色基质法。即将执行的中国药典2005年版将两部分进行了合并，并进行了修订，纳入了凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。浊度法是测定凝胶形成过程中的浊度变化，可进一步细分为终点浊度法和动态浊度法，在做细菌内毒素定量测定时，检测波长一般为360nm。显色基质法是测定特殊底物释放出来的生色团，也可分为终点显色法和动态显色法，定量测定的检测波长一般为405nm或545nm。
影响细菌内毒素检查结果的因素较多，一般包括：试剂因素（鲎试剂、内毒素标准品）；样品因素（pH值、温度、离子强度、浓度、可发生鲎试剂反应的非内毒素杂质）和实验因素（试验器皿、细菌内毒素检查用水、鲎试剂的抗干扰能力）等等。中国药典要求在实验前必须对试验器皿进行处理、复核鲎试剂灵敏度、考察供试品干扰试验等，以排除上述干扰，避免假性试验结果。上述试验实际上是方法学验证过程，以保证该方法的准确性和可信性。
方法确定之后，就需要根据品种用法用量等具体情况测算细菌内毒素限值。内毒素限值指单位药物（制剂）所含内毒素的最大浓度，中国药典2000年版和2005年版均采用公式L=K/M计算。其中K指注射途径内毒素致家兔发热阈剂量，或病人无任何不良反应的内毒素阈剂量，实际计算时为5EU/kg。M一般可以理解为每公斤体重1小时内给予药物的最大量（药物用量或输液体积）。对于静脉滴注制剂，通常采用1小时内输注的剂量，对于皮下肌肉或静脉注射，一般采用单次剂量计算。例如注射用头孢哌酮钠，其临床单次使用最大量为2g，按60kg、每小时所折算的限度应为0.15EU/mg。在实际操作过程中，根据惯例或者提高药品质量的要求，一般各国药典均在上述计算最高限度基础之上将限度要求提高2-3倍，如中国药典2005年版注射用头孢哌酮钠的细菌内毒素限值即为0.05EU/mg。
以上是细菌内毒素方法和限值计算的简要介绍。由于GMP的实施、细菌内毒素检查方法的经济性、药检所检查的方便性和准确性等因素，目前采用该法的申报资料逐年上升，已逐渐取代了热原检查法的地位，这体现了细菌内毒素检查方法本身的优越性，但部分申报资料中也或多或少存在一定问题，如：仅仅按照中国药典要求对该项进行检查，忽视了对方法学的验证，试验结果可信度低；另外由于不同厂商生产的鲎试剂其生产工艺、配方、质量参数等存在一定的差异，鲎试剂其抗干扰能力存在差别，但申请人忽视了对鲎试剂的选择，或对鲎试剂灵敏度的考察。在实验过程中未考察供试液浓度、pH值的影响，未进行干扰性试验等致使出现假阴性和假阳性试验结果；部分申请人未结合药物具体的临床用量，设置的细菌内毒素限值要求偏低，无法满足安全性要求；稳定性考察过程中，不注意选取安全性指标如细菌内毒素项目在最后时间点进行考察，不能对制剂的生物学稳定性有充分的把握；等等。凡此种种，都一方面可能影响申报进度，另一方面也不利于对产品安全性的全面认识，因此我们建议申请人在后续品种的研发和申报过程中，能够不断规范对细菌内毒素的研究工作。
以上为个人观点，希望与大家就此展开进行讨论交流，共同提高对细菌内毒素研究工作的认识。

参考文献
(1) 中国药学杂志1997年2月第32卷第2期
(2) 中国药事2000年第14卷第2期

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