ICH关于遗传毒性体外、体内试验的建议--ICHS2（R1）人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则介绍（二）

审评二部   黄芳华

      前文已介绍了ICH关于遗传毒性标准试验组合的要求，以下介绍ICHS2（R1）Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use（人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则）中关于体外、体内试验的建议。
一、对体外试验的建议
1、试验重复和分析
      实验结果的重现性是涉及新方法或意外发现的研究的基本组成部分。但是，用标准的、已广泛应用的遗传毒性试验进行常规试验时往往不需要完全重复。这些试验都经过很好的充分验证且有有效的内部控制，对明确的阳性或阴性结果试验通常不需要重复。理想状态是可明确宣称试验结果是明确的阳性或明确的阴性。但是，试验结果有时达不到阳性或阴性称谓的预先设定的标准，因此被定为“可疑”。统计学方法的应用有助于数据分析；但是，充足的生物学分析是至关重要的。可疑试验的重复可致(i) 一个明确的阳性结果，因此作为整体阳性结果； (ii) 一个阴性结果，所以结果不需要重复和总体结果为阴性；或  (iii)另一个可疑的结果，最后结论仍维持可疑。
2、对细菌突变试验的推荐方案
      OECE指导原则（1997）和IWGT报告(Gatehouse et al, 1994) 给出了对方案的建议。
2.1 高剂量水平的选择
最高剂量水平
      当不受溶解度或细胞毒性限制时，推荐最高浓度为5000µg/皿。
溶解度的限制
      对于细菌培养，如果沉淀不干扰评分应对沉淀量进行评分，毒性不限制，最高剂量不超过5000µg/皿。有证据表明在用细菌遗传毒性试验检测某些受试物时，在不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性。另一方面，明显的沉淀物可干扰对集落的计算或使受试物无法进入细胞并与DNA相互作用。如果未观察到细胞毒性，应以产生沉淀的最低浓度作为最高浓度。如果观察到剂量相关的细胞毒性或诱变性，则不管溶解度如何，则应按下面所述中的细胞毒性确定最高浓度。
细胞毒性限制
      在细菌回复突变试验中，最高剂量应表现出明显的毒性，但不超过最高浓度5000µg/皿。毒性可通过回复突变数目的减少，和/或背菌菌苔的清除或减少来检测。
2.2 试验设计/试验方案
      推荐的菌株组合（OECD）包括可检测碱基置换和移码突变的菌株，如下：鼠伤寒沙门氏菌TA98；TA100；TA1535；TA1573或TA97或TA97a；TA102或大肠埃希杆菌WP2 uvrA或大肠埃希杆菌WP2 uvrA（pKM101）。
      与OECE和IWGT报告建议的一个不同点是：基于检测药物的经验，当结果是明确的阳性或阴性，且是在完全充分的方案下进行（包括在有和无代谢活化条件下使用所有菌株，合适的剂量范围以满足高剂量选择的标准，合适的阳性和阴性对照）时，一个单独的细菌突变（Ames）试验足够，而且，对于检测药物，无论是平板掺入法或预培养法对于该单一试验都是合适的（注释7）。可疑或弱阳性结果可能提示重复度试验的必要性，可能需调整方案，如合适的剂量水平间距。
3、对哺乳动物细胞试验的建议
      OECE指导原则（1997）和IWGT出版物(Kirsch-Volders et al 2003; Moore et al 2006) 给出了对方案的建议。此处将说明对于检测药物与这些建议的不同点，特别是与最高浓度、细胞毒性和浓度相关的高浓度的选择（详见下文）。
3.1 高浓度的选择
最高浓度
      当不受溶解度或细胞毒性限制时，推荐的最高浓度是1 mM或0.5 mg/ml（选择任一更低者）（注释8）。
溶解度的限制
      当溶解度受限时，若不受细胞毒性限制，最高浓度应是培养基中产生最少可见沉淀的最低浓度（若其不干扰评定）。应通过诸如光镜、连续稀释沉淀、或培养过程中的外观等方法来评价沉淀（在给药结束时）。
细胞毒性
      在中期相染色体畸变或微核的体外细胞遗传学试验中细胞生长减少无需超过50%（注释9和10），或在小鼠淋巴瘤tk 突变试验中RTG（相对总生长率）减少无需超过80%（注释9）。
3.2试验设计/试验方案
      在体外中期相细胞进行染色体损伤的细胞遗传学评价，试验方案包括在有或无代谢活化、合适的阳性和阴性对照情况下进行试验。受试物应接触作用3-6小时，取样时间大约在从给药开始后的1.5个正常细胞周期。在有或无活化代谢状态下短期给药结果为阴性或可疑结果时，在无代谢活化情况下必须持续给药至取样的大约1.5个正常细胞周期，同样的原理也适用于体外微核细胞试验，除了取样时间为从给药处理开始后的1.5-2个正常细胞周期以让细胞完成有丝分裂和进入下一个分裂间期。对于两种体外细胞遗传学试验，某些化合物在更长时间的给药处理、延长取样时间或恢复期后更易检测到，如某些核苷类似物或亚硝胺类。在中期相畸变试验中，通过记录中期相多倍体（包括核内复制的）占中期相细胞的百分比率可获得倍数状态信息。有丝分裂指数（MI）或多倍体细胞出现频率的升高可提示化合物可能具有诱导多倍体的潜力。对于小鼠淋巴瘤tk试验，试验方案包括有合适的阳性和阴性对照、加和不加代谢活化的试验，试验方案包括在有或无代谢活化、合适的阳性和阴性对照，受试物应接触作用3-4小时的情况下进行试验。在有或无活化代谢状态下短期给药均得到阴性或可疑结果时，在无活化代谢情况下必须持续给药约24小时。合适的小鼠淋巴瘤tk试验包括（1）含有主要诱导小集落的阳性对照；（2）应对阳性对照、溶剂对照、至少一个阳性受试物浓度（必不可少），包括使突变体发生率最高的培养基的集落大小进行测定。
      对体外哺乳动物细胞试验，可采用诸如上述所列出（如不同的给药周期、有和无代谢活化的试验）的内在的确证因素。在这些试验后，试验结果为明确的阴性或阳性或时通常无需进一步的确证性试验。对于可疑或弱阳性结果可能需要重复试验，可能需调整方案，比如合适的受试物浓度间距。
3.3 阳性对照
      同期阳性对照是重要的，但是遗传毒性的体外哺乳动物细胞试验已充分标准化，使得染色体畸变试验和MLA试验可仅在活化状态下采用阳性对照（若与非活化试验同期进行），以证明代谢活化系统的活性和试验系统的反应性。

二、对体内试验的建议
1、检测染色体损伤的体内试验
      采用骨髓细胞分析染色体畸变或检测微核化的嗜多染红细胞的体内方法均可用于检测断裂剂。大鼠和小鼠均适用于骨髓微核试验。微核也可通过小鼠外周血中未成熟（如嗜多染）红细胞或大鼠血液新生网织红细胞测定（注释3）。同样，来源于被认为对检测断裂剂/非整倍体诱导剂有足够灵敏度的其他种属的骨髓或外周血的未成熟红细胞也可使用（注释3）。染色体畸变也可通过给药啮齿类动物的外周淋巴细胞培养来分析（注释11）。
      注意：当没有进行体外哺乳动物细胞试验（选择2）时，建议进行体内微核试验，而不是中期相染色体畸变试验，以包含更多直接检测染色体丢失（可能导致非整倍体）的能力。
2、微核的自动化分析
      如果已被验证适合，可采用自动化分析系统（图像分析和流式细胞计量术）（OECD, 1997; Hayashi et al 2000; 2007）。
3、其他体内遗传毒性试验
      与标准组合（选择2）中的第二种试验同样的体内试验，可用作追加试验以在评价体外或体内试验结果时加大证明力度（注释4和11）。虽然体外试验中可见的作用类型和任何代谢信息可有助于指导体内试验的选择，染色体畸变或内源基因的基因突变的研究在很多组织上采用标准方法是不可行的；当在转基因啮齿类动物上检测突变时，需延长给药时间（如28天）以使突变表达/固定，尤其是在有极少细胞分裂的组织上时。因此，第二种体内试验经常评价替代（DNA损伤）终点。已有大量对方案方面的公开经验和建议的试验包括：DNA链断裂试验如单细胞凝胶电泳（“彗星”）试验和碱洗脱试验，体内转基因小鼠突变试验和DNA共价结合试验，所有这些试验均可采用多种组织（注释4），除了肝脏程序外DNA合成（UDS）试验。
4、体内遗传毒性试验啮齿类动物雄性/雄性的使用
      若检测性别特异性药物，试验应在适宜的性别中进行。短期的体内试验通常仅在一种性别中进行（注释12）。只有在已有的毒性/代谢资料提示在所用种属上存在明显的性别差异时，短期试验才考虑采用两种性别。否则，对于短期试验单用雄性即可。当该遗传毒性试验结合在两种性别的重复给药毒性试验中时，应对两种性别进行采样，但是如果毒性/代谢方面没有明显性别差异，应对单一性别进行评分。对性别评分的剂量水平需符合合适的剂量水平标准（4.7.2和4.7.3节）。
      类似的原则可应用于其他已建立的体内遗传毒性试验。
5、体内遗传毒性试验中多次给药的使用及与毒理试验的结合
5.1 采样时间
      当微核试验结合在多周给药试验中时，血或骨髓的采样应在末次给药的次日（见下面的附加采血样的建议）。
      当在多周试验（如28天）血或骨髓用于微核测定时，明显的血液毒性可影响检测微核的能力，即在短期给药后可诱导可检测到的微核升高的剂量也可能毒性太大，使多次给药后无法分析。在给药2~4天时附加采血样是有用的(Hamada et al, 2001)；见4.7.3节。如果需要为染色体断裂剂和潜在非整倍体检测提供证据可采用早期取样（除了注释13和17外）。
      对于其他遗传毒性试验，采样时间根据测定终点进行合理选择。对于染色体损伤/链断裂测定，通常在末次给药的几个小时（如2~6小时）内取样。原则上，只要最高剂量/暴露是合适的，任何周期的试验均是适当的。
5.2 可分析的动物样本数
      可分析的动物样本数取决于微核试验（OECD）或其他遗传毒性试验的当前建议，通常不包括毒性试验中所有的给药动物。（用于遗传毒性分析的动物应随机选择）。
6、给药途径
      通常给药途径应与临床拟用途径一致，如口服、静脉或皮下，但是若为获得全身暴露需要，也可进行调整，如对于局部给药的化合物（见2.3.4节）。
7、体内试验的剂量选择
      应采用有代表性的三个剂量水平（Hayashi et al, 2005）。
7.1 短期试验
      对于短期试验（通常是给药1~2次）方案，遗传毒性试验推荐的最高剂量是：极限剂量2000mg/kg（若可耐受），或最大耐受量，例如：微核试验（OECD 474）采用产生明显毒性的剂量，基于同样的剂量范围，稍高一些剂量即预期会产生死亡。（同样的建议也用于彗星试验[Hartmann et al, 2003]）和转基因突变试验[Heddle et al, 2000]。剂量选择时也应考虑骨髓红细胞抑制的发生。稍低剂量通常应在该剂量下的约2~3倍间距。
7.2 多次给药试验
      在选择1组合中，当毒性试验符合人临床应用足够的研究的标准时，剂量通常被认为是合适的。但是，当进行追加试验以打寻遗传毒性试验表现时，或当在使用无体外哺乳动物试验的选择2时，为说明该高剂量适合于遗传毒性评价，应评估如下因素：
对于确定毒性试验（以大鼠为代表）的高剂量对于微核分析和对于其他遗传毒性评价是否合适的建议（下列的任何一条）：
      i. 最大给药量（MFD），基于在溶剂中的物理-化学性质特征 （如果在该溶液中的MFD与短期给药可达到者相似；注释14）。
      ii. 对于14天或更长时间的试验，如果能耐受，剂量限度为1000 mg/kg。
      iii. 暴露：
      a.高/饱和暴露
      b.蓄积
      母体化合物随时间暴露量明显减少（如比起始暴露量减少≥ 50%）常使该试验不可行。如果这种现象发生于一种性别，通常暴露量减少的该性别不被评分，除非其引起关注的代谢物的暴露量增加。
      iv 高剂量大于用于短期给药的高剂量的50%，即接近最死剂量，如果该短期给药资料由于其他原因可获得。（当前OECD指导原则中所述的短期给药微核试验的高剂量是高于预期有死亡剂量的剂量；对于其他体内试验也有相似的指导原则[e.g. Hartmann et al, 2003]。）
      仅基于无毒性的暴露界限（若干倍于临床暴露量）的高剂量的选择认为是不充分合理的。如果剂量水平/暴露不合适，短期体内试验应在最大暴露下进行，或获得合适的毒性范围（在同样动物上进行两种遗传毒性试验更佳），或者，如果还未完成，应进行体外哺乳动物细胞试验。
7.3 对多次给药试验剂量选择的附加指导原则
      可诱导非整倍体的化合物，如纺锤体抑制剂，仅在接近毒性剂量的狭窄的剂量范围内可被骨髓或血的体内微核试验检出。对于某些断裂剂也是如此。如果毒性资料提示对红细胞系有严重毒性（如明显的PCEs或网织红细胞抑制），剂量间距应不超过高的、毒性剂量之下的大约2倍。如果多周给药试验中不包含合适的剂量，就必需有附加的资料以确保可检测到非整倍体和某些毒性断裂剂；这些来源于以下的任一一种：
      a. 在多周给药试验中在明显血液毒性产生之前的2~4 天采血样
      b. 一项体外哺乳动物细胞微核试验
      c.一项短期骨髓微核试验
8、对于体内试验阴性结果的靶组织暴露的证据
      在遗传毒性试验策略中，体内试验意义重大。体内试验结果的意义与确定受试物在靶组织中有足够的暴露直接相关，尤其是当体外试验显示出有令人信服的遗传毒性而体内试验结果为阴性时，或者是未进行体外哺乳动物细胞试验时。足够暴露的证据包括有疑问组织的毒性、或毒代动力学资料。
8.1 当体外遗传毒性试验结果为阳性（或未进行）时
      体内暴露的评估应在最高剂量或其他相关剂量，采用与遗传毒性试验相同的种属品系及同样的给药途径上进行。当遗传毒性试验检测到遗传毒性时，作为毒理学评估一部分的暴露信息通常可获得。
体内暴露的确认可由以下任何一种方法进行：
      i. 细胞毒性
      a. 对于细胞遗传学试验：通过微核试验所用的各剂量组和各采样时间点，所用组织（骨髓或血）中未成熟红细胞与红细胞总数的比例发生显著的变化而获得；或通过染色体畸变试验中有丝分裂指数显著的降低而测定。
      b. 对其他体内遗传毒性试验：应评价肝脏或其他组织的毒性，如通过组织病理学检查或血液生化学毒性指标。
      ii. 生物利用度
      a. 测定血液或血浆中的药物相关物质。骨髓是血液灌流性良好的组织，故血液或血浆中药物相关物质的水平通常与骨髓中观察到的情况相似。无论何种给药途径肝脏对于全身暴露的药物都是预期要暴露者。
      b. 直接测定靶组织中的药物相关物质，或组织暴露的放射自显影检测。
      如果全身暴露与预期的临床暴露相似或更低，可能需采用替代的方法，如 (i)采用不同的给药途径；(ii)使用更高暴露的不同种属； (iii)使用不同的组织或试验（见2.3.4节“使用标准体内试验的局限性”）。
      如果无法获得足够的暴露，比如化合物显示出在靶组织中的利用度极低，常规的体内遗传毒性试验的价值可能很小。
8.2当体外遗传毒性试验结果为阴性时
      若体外试验未显示出潜在遗传毒性，可采用上述任何一种方法，也可用为其他目的而进行的标准的啮齿类动物吸收、分布、代谢和排泄（ADME）试验结果，对体内（全身）暴露水平进地评估。
4.9 体内试验阳性对照的使用
      对于体内试验，在试验室已有使用该试验确定的资质后，不必要在每个试验中都包含有同期的阳性对照（注释15）。