微生物学检查方法验证与评价要求

审评三部  霍秀敏  宁黎丽  成海平  魏农农

[摘要]本文系统阐述了微生物限度和无菌检查法验证的内容和技术评价要求，目的是规范微生物限度和无菌检查方法验证工作，供注册申请人在进行微生物限度和无菌检查研究时参考，微生物限度和无菌检查的评价要求，可用于具体的审评工作。
[关键词] 微生物学检查；方法验证；评价要求。

一、概述
      本文中的微生物学检查方法包括微生物限度检查法和无菌检查法。微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料药、辅料受微生物污染程度的方法；包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。无菌检查法系用于检查药典要求的无菌药品、原料药、辅料等是否无菌的方法；若检查结果符合规定，表明在该检验条件下未发现微生物污染。
      中国药典2000年版及以前的版本虽然收载了微生物限度检查法和无菌检查法，但在如何保证检验方法的科学性及检验结果的准确性方面存在一些问题，与国外药典的相关要求比较有一定差距，关键是未明确对检验方法进行必要的方法学验证。以前品种的申报资料中一般仅提供微生物限度检查或无菌检查的检查结果，无方法学验证内容。但从保证药品安全性的实际出发，不同品种需要选择建立各自适当的检查方法，即使是仿制药，由于不同生产企业采用的工艺、辅料等的不同，其产品可能表现出不同的抑菌特性，进行微生物限度检查或无菌检查时，具体的检查方法也不能简单地照搬，需要通过试验验证核实已有的试验方法和检测系统是否适用，因此，也需要进行必要的方法验证。
      中国药典2005年版对微生物限度检查法和无菌检查法进行了修订完善，明确规定进行药品微生物限度检查或无菌检查时应进行方法验证，目的是确认试验中应选择药典收载的何种供试液制备方法、何种测定方法，以及验证确定的检测系统是否适用于该药品的检验。如果供试品有抑菌性，影响测定结果，则应采用适当的方法消除供试液的抑菌活性后再进行检查。也就是说，只有通过方法验证，才能确定针对具体品种的具体的检验方法，保证采用的方法的科学性和检验结果的准确性。
二、方法验证的思路
      首先了解供试品是否有抑菌性、抑何种菌，再考虑选择适当的方法消除或降低供试品的抑菌性，然后用试验验证所采用的方法已经消除了抑菌性（能使人工加入的各种试验菌生长良好），特别是能满足对产品最敏感菌的生长；最后将所作的试验记录在案，形成确认该供试品在该检验量及该检验条件下，已充分消除抑菌性，能确保试验结果准确可靠的验证报告。
      微生物限度和无菌检查方法验证试验可概括描述为：在采用的检验方法和过程中，通过分别加入规定量的代表性微生物，以验证供试品是否在规定的检验量、在所采用的检验条件下无抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供试品本身的以及操作系统中可能对微生物生长有影响的各种因素），并且所用方法对微生物生长无不良影响，从而确认检验方法的有效性，保证检验结果的准确可靠。整个试验过程中的每一个环节均应有合理的证明，保证其对结果的判断没有影响。
三、方法验证的重点
      1、验证制成适宜供试液的前处理方法，证明方法对微生物生长、检出无影响。
      2、验证样品有无抑菌性、抑什么菌？最敏感的菌是那一个？其结果将直接影响后续检验方法的选择和操作步骤的进行，同时是最终所选检验方法和操作步骤合理性的证明。
      3、验证消除样品抑菌性的方法，证明方法的有效性及方法对污染菌生长无影响；如何选择合理、适宜、简单有效的消除抑菌性的方法是当前验证工作的关键。
四、方法验证的步骤与内容
      1、制备验证试验用菌液
      按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。
      2、样品的前处理方法
      样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所用的处理方法对各试验菌的生长无影响。
      根据供试品的性状，选用以下适宜的方法，或几种方法联合使用：
      溶解：验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微生物的生长无影响。
      乳化：验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、使用量及对微生物的生长无影响。
      破乳：验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生物的生长无影响。
      萃取：验证有机相选择的合理性、有效性及对微生物的生长无影响。
      稀释：验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍数。
      离心：验证所用转速、时间和微生物的分布情况。
      应说明采取某种前处理方法的原因，如样品不需要特别的前处理就能制成均匀的供试液，这一步可以省掉，直接进入确定样品有无抑菌性的步骤。
      3、确定供试品是否有抑菌性、抑什么菌？
      通过文献资料或申报资料中的药效学资料，了解其对不同细菌的MIC，参考已经验证过的品种、抗菌药物可根据抗菌谱确定敏感菌、中成药抗菌谱不清楚，至少需选择一株细菌和一株真菌来试验。也可以直接通过验证试验确定抑菌性。
      试验确定抑菌性的方法：在规定量的供试液中加入试验用微生物10～100个，如微生物生长良好，说明供试品对该种微生物无抑菌活性。如已用药典规定的各试验菌进行了试验，结果均能生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验。如加入的微生物不生长或生长缓慢，说明供试品有抑菌性；如加入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢，这一种菌就是该样品的敏感菌。
      4、选择适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌性
      根据供试品的特性选择药典规定的消除其抑菌性的方法（一种或几种方法联合），或根据药物的化学特性，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效的中和剂；并通过模拟试验（验证试验）对消除或降低抑菌性的效果进行检验。
      无菌检查可采用：①薄膜过滤法；②中和法（目前药典仅收载β-内酰胺酶处理法）。
      ①薄膜过滤法适用于液体供试品和可溶于水的固体供试品（只要许可，应首先采用）。验证的重点是确定滤膜的适用性、确定冲洗的方法和冲洗液的用量。
      ②中和法适用于能充分被其灭活抑菌活性的样品（如β-内酰胺酶灭活β-内酰胺类、对氨基苯甲酸灭活磺胺类）。验证的重点是确定中和剂有效、证明对污染微生物的生长无毒性，以及加入的方法和加入量。
      检验供试品是否已消除或降低抑菌性的验证试验：每种试验菌为一组，每组两管，其中一管为供试品加试验菌管，另一管为试验菌对照管。
      结果判断：如平行3次独立试验，各管微生物均生长良好，说明供试品已消除了抑菌活性；可以进行该品的无菌检查。如有供试品管的微生物生长微弱、缓慢或不生长，说明供试品仍有抑菌性；应考虑进一步增加冲洗量或中和剂的用量，以消除抑菌性，并重新进行验证，直至验证证明已充分消除或有效降低供试品的抑菌性为止。
      微生物限度检查可采用：①培养基稀释法；②离心沉淀法；③薄膜过滤法；④中和法。
      ①培养基稀释法：取规定量的供试品/供试液加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品浓度降低至不显抑菌作用。该方法适用于不能采用薄膜过滤法且抑菌活性较弱的样品。验证的重点是确定培养基量增加至多少才能使供试品/供试液不显抑菌活性。
      ②离心沉淀法：利用沉降系数差异分离去掉药渣、含抑菌活性的部分，留下含微生物的部分。该方法适用于不能采用薄膜过滤等方法的样品。验证的重点是确定能将药渣、抑菌部分分离掉而留下微生物的有效的离心率。
      ③薄膜过滤法：同无菌检查法，常可与离心沉淀法联合使用。
      ④中和法：同无菌检查法。
      实践证明几种方法联合使用效果更好。薄膜过滤法和中和法是最有效的消除抑菌性的方法。但是应对样品采取某种消除抑菌性的方法的原因进行说明。
      由于微生物限度检查由菌数计数和控制菌检查两部分组成，所以，在检验是否已消除或有效降低抑菌性的试验中也应分别进行验证。
      微生物限度检查中的菌数计数属定量试验。验证试验是通过对加入的各种规定微生物的回收率试验进行。验证中可以仅选用已确定的敏感菌，这样可减少工作量，因为，能满足敏感菌生长的条件必然能满足其他菌的生长。也可以完全按照药典规定，逐一进行每种试验菌的验证：对每种试验菌均建立（1）试验组（供试液加菌液组）?菌数计数测得CFU1；（2）菌液组?菌数计数测得CFU2；（3）供试液本身对照组?菌数计数测得CFU3；（4）稀释剂对照组?菌数计数测得CFU4。验证试验和对验证结果的判断：应符合CFU4÷CFU2≥70%、（CFU 1－CFU3）÷CFU2 ≥70%。如两个回收率均≥70%，则说明所用方法已消除了供试品的抑菌性；可以按该方法进行该品种的菌数计数检查。如回收率小于70%，则说明供试品仍有抑菌性，应进一步考虑采取适宜的措施以消除其抑菌性，并重新进行验证，直至验证的回收率均≥70%，证明已充分消除或有效降低供试品的抑菌性为止。
      微生物限度检查中的控制菌检查属定性试验。验证试验应同时设置：（1）目标菌阳性对照管；（2）供试品＋目标菌管；（3）阴性对照管；（4）非目标菌对照管。验证试验和对验证结果的判断：（1）目标菌阳性对照管菌必须生长良好；（2）供试品＋目标菌管生长良好；（3）阴性对照管必须无菌生长；（4）阴性菌对照必须无菌生长。上述试验成立，则说明所用方法已消除或充分减低了供试品的抑菌性；可以按该方法进行该品种的控制菌检查。如出现（2）供试品＋目标菌管生长缓慢、或不生长，则说明供试品仍有抑菌性，应进一步考虑采取适宜的措施以消除其抑菌性，并进行重新验证，直至验证结果中（2）供试品＋目标菌管与（1）目标菌阳性对照管相同，证明已充分消除或有效降低供试品的抑菌性为止。如出现（3）阴性对照管有菌生长；（4）阴性菌对照管有菌生长；则说明试验不成立，所用方法不专属，应寻找原因并重新进行验证试验。
五、方法验证中应注意的问题与评价要求
      1、验证试验的完整性
      验证试验的完整性与方法的科学性密切相关，验证工作不完整，就不能全面体现供试品和试验过程对微生物的影响情况，则很可能影响或干扰对最终试验结果的判断。故应按照中国药典2005年版的要求进行方法验证。特别是对某些具有抑菌性的供试品，需采取适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌性。在对供试品进行特殊处理时，既要考察供试品的抑菌性，还要考察在供试液制备过程中微生物受影响的程度（稀释剂对照组）。
      2、试验操作方法
      中国药典2005年版无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，微生物限度检查法包括平皿法和薄膜过滤法。薄膜过滤法采用大取样量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作简单；全封闭的过滤系统，避免了操作过程中外源性细菌的污染，对试验结果可信性影响较小。故尽量采用全封闭的薄膜过滤法。
      3、样品的前处理
      样品的前处理可采用溶解、乳化、破乳、稀释、离心等方法，也可几种方法联用，但需说明采用的处理方法的理由，并证明所用处理方法对各试验菌的生长无影响。
      对非水溶性的供试品，如果溶解冲洗不完全，会影响试验结果；故应注意使用加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂和稀释剂，或用十四烷酸异丙酯处理油类供试品等。
      4、方法的再验证
      建立微生物学检查方法时必须进行方法学验证，以证明所采用的方法适用于该药品的生物学检查。如果产品的组分或原检验条件发生改变时，应考察改变对微生物生长的影响，并进行方法的再验证；目的是考察验证结果的稳定性并及时发现影响微生物生长的因素。
      5、质量标准中【无菌】或【微生物限度】项下内容的撰写
建立微生物学检查方法时必须进行方法学验证，并应将验证的方法描述在质量标准中【无菌】或【微生物限度】项下。
      目前质量标准中【无菌】项下常见的描述为：1、取本品，依法检查（中国药典2005年版二部附录Ⅺ H），应符合规定；2、取本品，用薄膜过滤法处理后，依法检查（中国药典2005年版二部附录Ⅺ H），应符合规定。微生物限度检查则包含在相应的制剂通则中，描述为“照微生物限度检查法（附录Ⅺ J）检查，应符合规定”。
      不同处方工艺制剂的微生物学检查方法和检验条件不同，只有将经过验证确认可行的检验方法和检验条件完整描述在质量标准中，实验人员才能进行无菌检查及微生物限度检查操作。
      质量标准中【无菌】或【微生物限度】项下应描述经验证试验确定的检验操作方法：包括样品的前处理方法、步骤，判断有无抑菌性的依据，消除抑菌性采用的具体方法及各方法操作的关键点等。
      【无菌】项下应包括：供试品的制备（包括样品的前处理方法）、采用的检查方法（薄膜过滤法或直接接种法）、采用的冲洗液及冲洗量（如采用薄膜过滤法），以及标准规定（不得有菌生长，应符合规定等）。
      对中国药典要求进行微生物限度检查的制剂，在起草质量标准中微生物限度检查时应考虑：（1）微生物限度作为检查项单独列出；（2）【微生物限度】检查项下应包括：供试品的制备（包括样品的前处理方法）、采用的检查方法（薄膜过滤法或平皿法、或是自然沉降法结合薄膜过滤法、或是低速离心法结合薄膜过滤法）、采用的冲洗液及冲洗量（如采用薄膜过滤法），以及标准规定（细菌数、霉菌和酵母菌数的限度，控制菌不得检出等）。
      6、对方法验证结果和验证报告的评价
      通过所报的敏感菌来验证检查结果的可靠性。
      首先应按给药途径确定品种应符合无菌检验还是微生限度检查，确定验证项目。如应进行微生物限度检查，确定该品种规定的微生物限度标准，再确定应验证哪些项目。样品的前处理方法应合理，并有采用方法不影响微生物生长的证据。对供试品的抑菌性、抑什么菌？最敏感菌是那个？应有依据或试验结果来证明；如证明供试品有抑菌性，应验证所选消除抑菌性方法的合理性和有效性。判断经验证所确定的检验方法和试验条件是否能满足最敏感菌的要求。
      以上是微生物学检查方法验证与评价要求，希望与大家共同探讨。