半合成抗生素的制备工艺特点及技术评价要素探讨

审评三部 张哲峰 马磊 张星一

摘要：本文针对半合成抗生素制备工艺的特殊之处，归纳了其研发和审评中的关注点：起始原料（发酵产物）组份和结构特点导致的终产品组份和产品纯化问题；起始原料（发酵产物）的结构特点导致的合成路线选择性问题，由于原料药的活性基团较多，必须对反应进行过程控制；天然来源起始原料的立体构型经合成反应后引起的构型转化问题；毒性或无效杂质及异构体的限度问题；起始原料（发酵产物）的合法来源问题。

   天然抗生素的化学结构经适当修饰以改善其性能，是探索开发新药的有效途径之一，得到的化合物称之为半合成抗生素。天然抗生素的结构修饰在扩展抗菌谱、增强抗菌活性、克服耐药性、提高稳定性、改善药代动力学特点（提高血药浓度、改善组织分布、延长消除半衰期）、降低毒副反应以及适应制剂需要等方面取得了可观成绩。在历年上市的新抗生素中，半合成抗生素所占比率逐年上升，2001年以后上市的6种新抗生素均为半合成抗生素。
   在天然抗生素的结构修饰中一般采用化学方法：半合成法简便易行，但结构可变的幅度有一定限制；全合成法虽可大幅度改变结构，组合化学法便于高通量筛选，但路线较长，对工艺条件要求严格，所产生的异构体、相关杂质多而复杂，用到大量有机溶剂，产品纯化精制比较困难，具有相当大的难度；近年还有采用添加前体的生物合成与生物转化等方法，以及采用基因工程、细胞工程以及组合生物合成等生物学方法。在天然抗生素的结构修饰方法中，半合成法仍占主导地位。尤其在我国目前的注册申报中基本都采用的是半合成方法。
   抗生素的半合成制备工艺同一般化学药的化学合成工艺相比，存在一些特殊之处，主要表现在所用天然来源起始物不同于普通的化工产品，在化学结构、组份以及来源等方面都有其独特之处，值得在研发和审评中予以关注。
   首先，其起始物为生物发酵产物，与一般的化学合成品相比，具有纯度较差、组份多且复杂的特点，因其组份的化学结构类似，多为同系物，纯化分离较为困难，同样会参与后续的合成反应，导致多种副产物的产生，给中间体的纯化和质量控制以及终产品的纯度和质量带来一定影响，有时得到半合成抗生素同样是一种多组份抗生素，控制原料组份和反应条件会直接影响到产品质量。
   目前常用大环内酯类抗生素乙酰螺旋霉素即是一个典型实例，该品早期研究时由于受到分离分析技术的制约，对起始原料螺旋霉素的组份情况不是十分清楚，后经中国药品生物制品检定所专家对国产和日本进口的乙酰螺旋霉素进行对比分析后，清晰揭示了该品的结构和组份情况，螺旋霉素中主要有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个组分，其中螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ最终被合成为单、双乙酰螺旋霉素Ⅱ，螺旋霉素Ⅲ最终成为单、双乙酰螺旋霉素Ⅲ，目前临床应用的乙酰螺旋霉素为单乙酰螺旋霉素Ⅱ、单乙酰螺旋霉素Ⅲ、双乙酰螺旋霉素Ⅱ、双乙酰螺旋霉素Ⅲ四个组份的混合物，其效价之比为1250：1200：1200：1500。因此，得到较好的单、双乙酰螺旋霉素比例，是提高成品效价的关键。
  研究表明，螺旋霉素原料对成品的效价有很大的影响，不同来源的螺旋霉素在乙酰化过程中会有较大的差异。因此，在生产过程中需要及时跟踪反应进程，适当调整酰化时间或催化剂用量，以控制螺旋霉素的酰化程度；由于双乙酰螺旋霉素Ⅲ与其他三个主要成分相比效价明显要高，因此在选择螺旋霉素原料时应尽量用螺旋霉素Ⅲ组分较多的原料，另外DMAP的用量在反应中是一个关键的因素。如用量少，成品中单乙酰螺旋霉素的量相对增加，双乙酰螺旋霉素相对减少，双乙酰螺旋霉素Ⅲ含量的减少必然导致效价的降低；如DMAP用多了，成品中双乙酰螺旋霉素含量过高，超过药典所规定的65%的限度，则导致药品不合格。同时还发现，不同的螺旋霉素原料所适用的DMAP用量也有较大的差异，且不同等级或批号的DMAP会给成品的总组分与单、双比例造成波动。研究还发现，在酰化反应中，反应时间、反应体系的pH值等因素会影响到产品质量和收率。
   对于氨基糖苷类抗生素异帕米星的合成情况也是如此，以庆大霉素B为母核，与侧链异丝氨酸反应即得本品，庆大霉素B由微生物发酵制得，所用棘孢小单孢菌突变株尚不是产生庆大霉素B的单组分菌种，发酵液中还含庆大霉素C族组分，故需对发酵液进行提取分离，并考虑这些组份参与后续合成反应后，对终产品组份情况的影响，氨基糖苷类抗生素的某些组份具有明显的耳毒性和肾毒性，因此，这些副产物的生物活性和毒性等是研发和审评的关注点。
   其次，作为生物合成的起始物，分子结构中含有的活泼基团（如羟基、氨基、醛基等）较多，而化学修饰时，仅希望修饰其中的一部分，而另一些官能团需要进行化学保护，因而，增加了合成制备工作的复杂性。
  氨基糖苷类半合成抗生素的制备中不但存在起始原料（发酵产物）的组份纯度问题，而且存在活泼基团的保护问题。威替米星由发酵产物威大米星为起始原料，在1－N进行乙基化修饰而得到，一般有三条合成路线：1）以威大米星为起始原料，直接同乙醛反应，然后进行硼氢化还原，分离纯化得到本品；2）以威大米星为起始原料，先制得3，2，6－三乙酰威大米星，再与乙醛反应生成Schiff碱，然后进行硼氢化反应还原，精制纯化，脱三乙酰保护基团得到本品；3）以威大米星为起始原料，溶解于DMF中，加入乙酸酐，保护2’，3，6’的三个氨基，得到3，2’，6’－三乙酰威大米星（I），中间体I溶解于乙二醇二甲醚（DME）中与六甲基二硅胺烷进行硅烷化反应，保护5，2’，4’的三个羟基，得到3，2’，6’－三乙酰－5，2’’，4’’－三硅烷化威大米星（II），中间体II与乙醛反应，生成Schiff碱（III），III再发生硼氢化反应，在1－N上连接乙基，经过NaOH处理，树脂纯化，硫酸成盐，得到硫酸威替米星。结构式见下：

对活性基团的保护问题在上述三种工艺中具有不同的措施，合成中不对拟不修饰的活性基团进行保护，得到的产物组份复杂，纯化分离的难度加大；对这些基团进行保护，可减少产物分离纯化的难度，但增加了合成反应的复杂性，在研发和评价中应对其权衡利弊，综合考虑。
   硫酸异帕米星的合成工艺同样存在类似问题，该品的常见合成工艺为：以庆大霉素B为起始原料，与正-叔丁氧羰基叠氮物反应，使6位伯胺的叔丁氧碳酰基酰化，再与S-N-（3-苄氧羰基氨基-2-羰基丙酰氧基）-琥珀酰胺反应，使1位苄氧羰酰异丝氨酸酰化，再氢化水解脱保护基叔丁氧碳酰基和苄氧羰酰基，得异帕米星，经离子交换树脂分离纯化后与硫酸反应得硫酸异帕米星粗品。用甲醇：水（3：1）的混合溶剂重结晶，再用二氯甲烷洗涤除去其它有机杂质。结构式如下：

问题是：庆大霉素B结构中1、3、6’位均连接氨基，反应活性相当，申报单位采用羟基硅烷化后产生的空间位阻作用降低3、6’位氨基的反应活性，以保证得到异帕米星。根据文献或专利，一般采用叔丁氧羰基法或甲酰基保护法直接保护3、6’位氨基，又根据本品有关物质检测结果，3位氨基进行酰化的副产物约2%，提示3、6’位氨基都有可能参加了反应，故建议在质量研究中应分析目前采用的有关物质检查方法是否能将可能产生的副产物检出，提供相关的检测图谱，根据检测结果决定是否订入质量标准。
   第三，起始原料（发酵产物）合法来源问题也是一个值得关注的问题，比如发酵菌种的来源、鉴定、发酵工艺的控制与产品组份和结构等质量信息间的关系等需要研发者和评价者予以关注。
   氨基糖苷类半合成抗生素的制备中通常所用起始原料大多结构类似，仅存在微小差别，比如有些起始物生产菌是在庆大霉素发酵菌种基础上进行诱变得到，甚至发酵产物为纯度较高的庆大霉素某一组份。因此，在其合成工艺的评价中，还需关注发酵菌种的来源和鉴定情况，尤其当所用发酵产物并不是获准上市药品时更需引起关注。异帕米星和威替米星的合成起始原料庆大霉素B和威大米星均为微生物发酵制得，且均不是上市原料药，其生产菌和成熟的发酵技术仅为某些机构作掌握，因此，对这类原料的来源不能等同于普通的化工产品，需要提供详细的菌种来源、鉴别及传代稳定性等资料以及起始原料的质量标准（重点说明其组份纯度情况），并分析其它组份杂质经后续合成过程后，可能生成的副产物及其控制措施。
   第四、天然来源起始原料的分子结构中大多存在构型问题，有时这些构型的稳定性不是十分稳固，需要考虑在后续的化学合成过程中是否会引起这些构型的转化，以及如何对此进行监控并予以保护。
威替米星及其合成起始原料威大米星均有12个手性中心，虽然从两个结构式看，手性中心的位置没有发生改变，但在合成中，尤其活泼基团的保护和解保护以及反应过程的酸碱环境等因素是否会引起手性中心的构型转化，需要说明在合成过程中如何保持现结构的稳定性，并说明在合成过程中保持结构稳定的措施以及验证方法。
   第五、天然抗生素的结构修饰中特定副反应的控制也是研发和审评中值得关注的一个问题。如β-内酰胺抗生素类抗生素是另一类临床用量很大的半合成抗生素。通常采用7-ACA或7-ADCA为原料进行结构修饰。合成过程中应重点关注的问题包括△－异构体（即双键的位置异构体）及侧链肟基的顺反异构现象。
   由头孢菌素构效关系我们知道，△3头孢烯类头孢菌素是无活性的。从现有文献资料可知该异构体产生的途径住友有三条：1）由起始原料引入，如头孢氨苄，终产物中的△异构体是由7-ADCA中残留的△3异构体引入；2）在保存过程中降解产生，如头孢泊肟酯，头孢呋辛酯等。3）在合成过程中引入，如头孢吡肟，头孢他啶；文献显示，在合成过程中引入△3异构体时，受多种因素影响，如化合物结构，反应的路线、关键步骤使用的试剂种类、试剂加入顺序、反应的立体选择性，以及反应温度等。例如在合成头孢吡肟的过程中，母环引入N-甲基吡咯烷的反应可以同时生成△3/△2异构体，其中△3异构体的含量与合成路线是先3位取代后7位酰化或先7位酰化后3位取代、以及反应的具体工艺条件如反应溶剂，反应温度等密切相关。
   在第三代和第四代头孢菌素的结构中，通常会有一个甲氧肟基，如头孢噻肟、头孢唑肟、头孢甲肟、头孢曲松、头孢唑喃、头孢他啶、头孢克肟、头孢匹罗、头孢吡肟，头孢唑兰，以及单环类β－内酰胺氨曲南等等，目的是提高药物对β－内酰胺酶的稳定性。但甲氧肟基具有顺-反异构现象，且两个异构体间的活性差别非常大，如头孢噻肟（顺式结构）抗菌活性要比反式结构强40～100倍。甲氧肟基的顺-反异构反应对紫外光非常敏感，如头孢噻肟钠水溶液（2×10-3M），254nm紫外光照射45分钟有50％降解，4小时后损失95％，感光降解产物主要是反式异构体。中国药典纳入的头孢曲松即采用将其水溶液在紫外线照射后产生反式异构体进行系统适用性试验。另外，反应温度、pH对顺-反异构体的比例也有显著影响。因此，应针对以上敏感因素进行重点研究，通过大量的实践摸索，找到最佳的工艺条件，并在生产过程中进行严格控制。
   综上，在对半合成抗生素的制备工艺评价中，应注意以下几个方面的问题：一、起始原料（发酵产物）组份和结构特点导致的终产品组份和产品纯化问题；二、起始原料（发酵产物）的结构特点导致的合成路线选择性问题，由于原料药的活性基团较多，必须对反应进行过程控制；三、天然来源起始原料的立体构型经合成反应后引起的构型转化问题；四、毒性或无效杂质及异构体的限度问题；五、起始原料（发酵产物）的合法来源问题。