关于原料药有关物质检查方法建立的思考

审评四部七室赵慧玲

【摘要】本文针对审评原料药有关物质检查方法中存在的问题，介绍欧洲和英国药典关于原料药已知杂质的研究现状和有关物质方法建立及质量控制，以供申请人参考。
【关键词】有关物质、方法学、分离度。

笔者审评原料药有关物质检查方法中发现，大多申请人越来越多地认识到控制原料药有关物质的重要性，自行建立方法考察原料药中存在的有关物质。但在研究中往往片面认为样品通过了破坏性试验和1％自身对照法后的系统适用性试验就符合了要求。因此，忽视对主成分中杂质产生原因的分析，忽视仪器的检测灵敏度的分析、忽略色谱柱（柱效）的选择、流动相及比例的选择、检测波长的选择。忽视主成分和可能产生的杂质分离度的问题。
1、原料药有关物质方法建立应关注的问题：
原料药中的杂质来源于合成的中间体、副产物、以及降解产物，建立方法初期，仅采用破坏性试验的方法考察降解产物的做法是片面的。由于降解产物的量较小，如果选择的方法不好，比如，柱效低，波长选择不合理、流动相及流动相比例不合适，即使有降解产物，也达不到有效的灵敏度和有效的分离。因此，一个好的分析方法的建立首要问题应是围绕主成分和杂质的分离度和检测波长进行。对于生产原料药的企业来讲，由于可以通过工艺得到中间体、副产物，在方法建立初始，首先应该将可能的中间体和副产物作为杂质对待，进行柱效、流动相及流动相比例、波长和分离度等方法学的研究。方法建立成熟后，可根据中间体和副产物的安全性和工艺得到的难易程度决定是否固定为已知杂质。如果工艺中难以得到，且比较安全，可考虑采用杂质校正因子加上相对保留时间的方法。或采用杂质相对保留时间加上自身对照方法。上述三种方法均有好的分离度和响应值（灵敏度）作保证。也是研发和审评中应当提倡的。
如果原料合成中确实得不到副产物，对于有紫外吸收的样品可以用二极管阵列检测器，考察未精制的粗品，并对比已精制过的样品，确定粗品中各成分的分离度和样品中可能杂质的检测波长。方法确立后，可采用自身对照方法或面积归一化法控制杂质。对于后一方法，在研发和审评中应当慎重选用。
如果证明上述四个方法是比较成熟的方法后，如果再加上破坏性试验考察降解产物，其方法就更加完整和适用。
2、介绍欧洲和英国药典控制有关物质关注的问题
欧洲和英国药典的原料药标准后面，大部分都附有可能产生的中间体和副产物的结构，在有关物质质量控制中有些采用已知杂质的方法；有些采用杂质校正因子加上相对保留时间的方法；杂质相对保留时间加上自身对照方法和自身对照方法或面积归一化法。
例如：核黄素磷酸钠的有关物质检查就是采用HPLC的已知杂质－核黄素、其他杂质相对保留时间加上自身对照的方法。
取本品0.1g，用水50ml溶解，并用流动相稀释至100ml，取该溶液8ml，用流动相稀释至50ml，作为供试品溶液。另取核黄素对照品60mg，加盐酸试液1ml溶解，用水稀释至250ml, 取该溶液4ml，用流动相稀释至100ml，作为对照品溶液(a)。再另取核黄素磷酸钠对照品0.1g，用水50ml溶解，并用流动相稀释至100ml，取该溶液8ml，用流动相稀释至50ml，作为对照品溶液(b)。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（填充剂粒度：5μm；柱长：0.25m；内径：4.6mm）；以甲醇－7.35g/L磷酸二氢钾溶液（150：850）为流动相；检测波长266nm；流速2ml/分。5－单磷酸核黄素的保留时间为20分钟；其他相对保留时间：3，4－二磷酸核黄素大约0.2；3，5－二磷酸核黄素大约0.3；4，5－二磷酸核黄素大约0.5；3－单磷酸核黄素大约0.7；4－单磷酸核黄素大约0.9；核黄素大约2。
取对照溶液（a）100μl注入液相色谱仪，调节主峰高度为满量程的50％；再注入对照溶液（b）100μl，记录色谱峰直到核黄素的峰面积能被准确计算，且4－单磷酸核黄素峰与5－单磷酸核黄素峰的分离度应不小于1.5。
精密量取供试品溶液、对照溶液（a）和对照溶液（b）各100μl，分别注入液相色谱仪，供试品溶液的色谱图中，如有与核黄素峰保留时间相应的色谱峰，其峰面积不得大于对照溶液（a）主峰面积（6.0％），二磷酸核黄素面积的和不得大于对照溶液（a）主峰面积（6.0％），且均应以干燥品计。
3、结合国内研发核黄素磷酸钠的状况提几点建议
在审评核黄素磷酸钠原料和注射剂有关物质的过程中发现，申请人常参照中国药典收载的核黄素磷酸钠及注射液标准项目进行。忽视了国内外标准和国内同品种质量的调研，盲目申报。一些资料中单磷酸核黄素的分离度并不好，从图谱看起来，表面上其质量比国外标准的质量好，但实际上是单磷酸核黄素等多个组分并未得到有效分离。虽然国外将各单磷酸盐均看成有效成分，而未作为杂质控制，但在方法学研究中，的确关注了各单磷酸盐的分离度，这应是方法学研究的重点。如果建立的方法不能使每一个成分分离，这个方法就不是一个好的方法。
从这个例子分析，审评中不能简单认为杂质个数少了，质量就好，杂质个数多了，质量就差，一定要结合分析方法的好坏，经过综合分析判断后下结论。否则，容易犯主观主义和片面主义的错误，将由于因分析方法的分离度较差而导致的杂质个数少的药品误认为质量好。其实，药品中包含着没有分开的成分，这个成分很可能是最不安全的成分。因此，一个药品的有关物质方法的评价更应重视分离度方法的评价，在分离度合适的情况下，比较检出杂质的个数才有意义，不能简单的以检出杂质的个数多少论质量。
对核黄素磷酸钠，引起重视的应是分离度方法的问题，在有了好的分离度方法基础上，再根据每一个成分的安全性和生产工艺的成本，考虑对每一个成分的合理控制，这是有关物质研究的重点。在可能的情况下，推荐使用国外药典标准的有关物质检查方法和限度。
建议在仿制原料药时，首先应查阅国外药典同品种质量标准，借鉴国外的有关物质检查方法和限度，减少建立方法学和质量研究工作的盲目性。在未有文献可借鉴时，根据我国实际的研究水平，建立有关物质的检查方法。
其二，由于国内仿制的原料药是可以豁免临床研究的，不同的合成工艺对主药的影响不同，而可能的中间体、副产物、降解产物会不同。有关物质方法的确定一定要以工艺中的理论上的各成分的分离度为依据，并与已上市药品进行质量对比，确定可能的已知杂质或杂质相对保留时间保证方法的分离度。
其三，关注工艺杂质并兼顾原料药的降解产物的安全剂量，其限度可以以已上市药品的对照数据为依据。
原料药有关物质的控制方法对质量控制来说至关重要，它是衡量质量和稳定性一致性的尺子。因此，不能忽视有关物质检查方法的验证或方法建立。
上面是以审评核黄素磷酸钠原料和注射剂有关物质方法为例，说明方法建立应关注的重点问题是分离度，没有分离度作保证，方法的根基就不牢固。希望能对申请人的研发起到帮助，并减少申报资料的发补率。

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