对中药注射剂非啮齿类动物急性毒性试验若干问题的思考

审评二部张晓东

国家食品药品监督管理局于2007年12月6日颁布了最新的《中药、天然药物注射剂基本技术要求》，该版技术要求中明确了在中药、天然药物注射剂的非临床安全性研究中需进行非啮齿类动物的急性毒性试验。在2005年发布的相关指导原则中曾建议由中药、天然药物制成的注射剂一般采用两种给药途径（血管内给药可仅采用拟临床给药途径）、啮齿类和非啮齿类两种动物考察受试物的急性毒性反应情况[1]。但由于种种原因，在以往申报的中药、天然药物注射剂品种中进行过非啮齿类动物急性毒性试验的品种却为数不多。本文梳理了目前采用非啮齿类动物进行中药注射剂急性毒性试验可能面临的问题，并做了初步的分析和探讨，以期为相关工作提供一些参考。
1、采用非啮齿类动物进行中药注射剂急性毒性试验的必要性
不同种属的动物对同一药物的反应可能会有所不同。对于同一药物，在大鼠和小鼠中观察到的毒性反应可能基本相似，但在犬与啮齿类动物上的毒性反应却可能差别很大。有些反应是啮齿类动物所特有的，如眼球突出、竖毛反应等；但有些反应如呕吐、流涎等却是在大鼠和小鼠上观察不到的。目前，学术界普遍认为啮齿类动物和非啮齿类动物急性毒性试验所得的结果，无论是在质上还是在量上都会有很大的差别。因此，从充分暴露毒性的角度考虑，药物在首次人用之前，应从啮齿类动物和非啮齿类动物中获取较为充分的安全性信息。鉴于目前中药、天然药物注射剂面临的问题和实际情况及其给药途径的特殊性，充分暴露其可能的毒性，获取全面客观的安全性信息，是有其必要性的。
2、中药注射剂急性毒性试验所用非啮齿类动物种类的选择问题
就目前的研究条件而言，最为常用的是犬，如Beagle犬。兔（属于哺乳纲兔形目，而非啮齿目，故一般作为非啮齿类动物看待）由于其一般毒性的历史数据较少，在口服制剂和注射剂急性毒性试验中一般不予以采用；而灵长类动物由于来源有限，在急性毒性试验中一般也很少选用。日本的有关指导原则就要求急性毒性试验采用两种以上的动物进行，一种为啮齿类动物，一种为除兔外的非啮齿类动物[2]。另外，目前还很少见到采用小型猪等其他非啮齿类哺乳动物进行急性毒性试验的报道，因为也面临着毒性背景数据缺乏、动物来源有限等问题。
3、中药注射剂非啮齿类动物急性毒性试验的一般原则和特殊关注点
采用非啮齿类动物进行中药注射剂急性毒性试验应遵循一般药物急性毒性试验的原则，但同时又有其特殊性。这种特殊性主要是基于采用的动物是非啮齿类动物，而受试对象则是中药、天然药物制成的注射剂。从这个角度分析，采用非啮齿类动物进行中药注射剂急性毒性试验除了需遵循一般药物急性毒性试验的原则外，还需特别关注以下几点：
3.1、关于整体设计：对于中药注射剂的非啮齿类动物急性毒性试验，其重点在于观察动物出现的毒性反应，应以给药剂量和不同剂量下出现的毒性反应之间的剂量-效应关系为主线，亦即以近似致死剂量下观察量效关系为主，而非苛求LD50的精确测定。目前，国际上对于精确测定LD50的经典急性毒性试验方法的局限性有了较为清晰的认识。ICH三方就建议进行严格设计的、逐渐增加剂量的单剂量给药耐受性试验，用以取代采用啮齿类动物或非啮齿类动物进行的LD50测定。这种研究思路是比较适合于中药注射剂的非啮齿类动物急性毒性试验的。
3.2、关于实验动物数：急性毒性试验所用的动物数，应根据动物的种属、试验目的以及具体采用的试验方法来确定。非啮齿类动物相对于啮齿类动物，其数目可以适当减少；同时，实验动物数应符合具体采用的试验方法要求及其结果分析评价的需要。目前，世界各国相关指导原则的基本要求是在获得尽量多信息的前提下，使用尽量少的实验动物，这也包含了动物保护和节省资源的考虑。
3.3、关于观察指标及评价：如前所述，对于中药注射剂的非啮齿类动物急性毒性试验并不苛求LD50的精确测定。目前，国内有关指导原则建议采用适当的试验方法来测定最大无毒性反应剂量或最小毒性反应剂量，最大耐受剂量或近似致死量或最小致死剂量，或最大给药量等，以初步判断受试物的安全范围[1] [3]。在这些试验方法下应保证急性毒性试验一般原则下的观察时间和观察指标（如一般状况指标、动物死亡情况、体重变化、大体解剖、组织病理学检查等），并应结合具体受试物特点和试验方法，观察心电图、血液学、血生化、尿常规等尽可能全面的指标，根据观察结果进行分析归纳，判断各种反应的剂量－反应及时间－反应关系，判断出现的各种反应可能涉及的组织、器官或系统等，分析所出现的反应与药物作用的相关性，总结受试物的安全范围、出现毒性反应的时间和持续时间、出现毒性的严重程度及可恢复性等。
4、中药注射剂非啮齿类动物急性毒性试验的具体试验方法
采用非啮齿类动物进行中药注射剂急性毒性试验的方法有很多种，试验时可根据具体的受试物特点和不同目的要求进行选择。以下是几种常用的具体试验方法，供参考[3]：
4.1 近似致死剂量法：一般采用6只健康的Beagle 犬或猴，犬一般为4-6月龄，猴一般为2-3岁。根据小动物的毒性试验结果、受试物的具体特点和其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致兰亮糠段В蝗绻眉亮肯露锼劳觯蚋眉亮坑胱罡叻侵滤兰亮考涞姆段浦滤兰亮糠段А?lt;BR> 4.2 累积剂量设计法（金字塔法，Pyramiding dosage design）：经典的试验设计需要8只动物，分对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各2只。预先设计一个逐渐递增的剂量序列，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡或达到剂量上限。当没有动物死亡时，MLD（最小致死剂量）和LD50大于最高剂量或受限制剂量。当在某一剂量所有动物均出现死亡时，MLD和LD50应在最后两个剂量之间。当在某一剂量部分动物出现死亡，部分死亡出现在后继的下一个高剂量，此时，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一低剂量之间，LD50则应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间。假如没有动物死亡发生，常常以最高剂量给予动物5-7天，以确定后续的重复给药试验中高剂量的选择。该试验无法获得一条致死曲线，与真正的急性毒性试验相比，尽管更类似一短期、重复剂量的毒性试验，但对于那些无其他毒性资料的中药、天然药物注射剂能提供实用的和突出毒性特点的前期资料。
4.3 最大给药量法：这种方法比较适合于毒性相对较低的中药注射剂。指在合理的最大给药浓度及给药容量前提下，以允许的最大剂量单次给药或24 小时内多次给药，观察动物出现的反应，一般连续观察14 天。使用的动物数量，非啮齿类动物可以适当少于啮齿类动物，以能达到结果分析评价的要求为准。
5、结合中药注射剂的特殊性进行非啮齿类动物急性毒性试验
中药、天然药物制成的注射剂不同于其他非注射给药途径的中药、天然药物制剂，同时和化学药物比较又有其特殊性。因此，应结合中药、天然药物注射剂的自身特点和特殊性开展其非啮齿类动物的急性毒性试验，以下几点值得关注：
5.1 受试物应达到注射剂的制剂学要求，以排除非药物因素引起的影响
中药注射剂不同于一般口服制剂，首先是要满足作为注射剂本身在制剂学方面的安全性要求。目前有关指导原则建议急性毒性试验的受试物采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品[1]。但在中药注射剂急性毒性试验中往往需要提高剂量，因限于给药体积，增加药物浓度成了提高剂量的常用方法。药物浓度的增加，可能会引起注射剂性质的改变，如渗透压、pH值、刺激性、溶血性等的改变，对于溶解性不好需采用助溶剂或增溶剂的药物则更为明显。这些改变可能导致受试样品本身已不完全符合注射液的要求，如直接用以进行急性毒性试验往往会出现各种问题。此时应采取措施，对受试物的渗透压、pH值等进行调整，排除掉因制剂学因素（非药物因素）所导致的刺激性和溶血性等的影响，在受试样品具备注射给药制剂学条件的前提下进行非啮齿类动物的急性毒性试验。
5.2 选择合适的试验方法和剂量进行相对低毒中药注射剂的非啮齿类动物急性毒性试验
中药注射剂毒性作用情况往往比较复杂，尤其是多成分制成的中药注射剂。其中有不少中药注射剂的药理作用途径复杂，作用靶点不明确，集中反映的毒性不易暴露，因此可能在很高剂量下也难以观察到受试动物的明显毒性反应。对于此类毒性相对较低的中药注射剂，需要设计合适的试验方法和剂量进行其非啮齿类动物的急性毒性试验。对于有效成份（注册分类1）制成的中药注射剂，如其相对毒性较低，可以参考低毒性化学药物急性毒性试验的方法和设计思路进行整体实验的设计和合理给药剂量的设置。对于多成份（注册分类2－6）制成的中药注射剂，在经过充分的预试验确证其毒性相对较低，无法达到致死剂量的前提下，可以考虑选择最大给药量法进行其非啮齿类动物的急性毒性试验。
5.3 重视主动研究，强调对试验结果的综合分析
由于中药注射剂毒性复杂性，其急性毒性试验不应僵化地套用有关的技术要求和指导原则，应注重主动研究，具体问题具体分析，以获取尽可能多的客观的安全性信息；亦不应仅停留于试验项目的开展，而忽视对试验结果的分析，需要对急性毒性试验的结果进行综合分析和评价，对受试物的开发前景进行充分的评估，并为后续的重复给药毒性研究及临床试验实施提供尽可能多的参考信息。

非啮齿类动物急性毒性试验是中药注射剂非临床安全性研究的重要内容之一，将对随后的重复给药毒性试验剂量设计和观察指标选择、Ⅰ期临床试验起始剂量的确定、受试物可能毒性作用的初步揭示、以及药物继续开发的前景评估等起到重要的参考作用。希望此文中对有关问题的思考和分析探讨能为相关试验的开展和研究评价提供一点参考。

参考文献：
1. 国家食品药品监督管理局.中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则.2005
2. 医药品非临床试验研究会.单回投于毒性试验.日本临床前研究指导原则解说[M]. 东京：药事日报社，2002：11-14
3. 国家食品药品监督管理局.化学药物急性毒性试验技术指导原则.2005

对中药注射剂非啮齿类动物急性毒性试验若干问题的思考

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