应用纳米材料的医疗器械安全性和有效性评价指导原则第三部分：生物相容性毒理学评价

2024-08-12

2024年第23号

其他

中国

现行有效

2024-08-12

国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心

应用纳米材料的医疗器械安全性和有效性评价指导原则第三部分：生物相容性/毒理学评价

本指导原则为注册申请人/监管人员提供关于应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价相关方面的信息。

本指导原则是对应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价的一般要求，注册申请人应依据具体产品的特性对注册申报资料的内容进行充分说明和细化。注册申请人还应依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述理由及相应的科学依据。

本指导原则是对注册申请人和审评人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能满足相关法规要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。

一、适用范围

本指导原则适用于与人体直接或间接接触，由纳米材料组成或包含纳米材料的医疗器械的生物相容性/毒理学评价。

不适用于：

- 应用纳米材料的体外诊断（In Vitro Diagnosis，IVD）产品；

- 应用纳米材料的赋能技术（如纳米机器人）；

- 应用纳米材料的药品；

- 应用纳米材料的医疗器械在制造和废弃过程中造成的职业和环境风险。

二、医疗器械中与纳米材料相关的风险识别和风险评估的层级评价方法

本指导原则描述的应用纳米材料的医疗器械，是指注册申请人在医疗器械产品中应用了纳米材料，且该纳米材料被设计为发挥预期功能。此类医疗器械的生物学评价应首先执行GB/T 16886系列标准文件及医疗器械法律法规的内容，再结合本指导原则描述的纳米材料特殊考虑点进行相关研究。纳米材料的安全风险与常规材料不同，主要取决于纳米材料的化学成分、物理化学性质、纳米特性、纳米结构与形貌、与组织相互作用方式以及暴露途径与水平等。相比于常规材料，纳米材料在样品制备时会有溶解性和分散性的区别，以及稳定性和均一性的要求，因此可能需要考虑纳米材料在样品制备时的特殊性；由于纳米颗粒被认为可能穿越所有生物屏障，包括血脑屏障和胎盘屏障等，因此可能需要考虑纳米材料的全身毒性，特别是中枢神经系统毒性和生殖/发育毒性；“纳米蛋白冠”的形成，可能会影响其生物响应、动力学、蓄积和毒性等生理效应；有些纳米材料具有类佐剂特性，可能会对免疫系统产生影响，需要关注免疫毒性；纳米材料被单核吞噬细胞系统清除、在特定组织器官分布、形成“纳米蛋白冠”等，可能改变其毒代动力学特征。因此，应用纳米材料的医疗器械生物学评价内容，在兼顾GB/T 16886系列标准文件中关于常规器械评价内容的基础上，重点考虑与纳米材料有关的其他问题，如样品制备，吸收、分布、代谢和排泄/清除（ADME）、中枢神经系统毒性和免疫毒性等。对应用纳米材料的医疗器械进行生物相容性/毒理学评价时，需根据GB/T 16886.1附录A中描述的生物学评价框架开展评价，并参考GB/Z 16886.22、本指导原则第三章及附件一中所描述的纳米材料特殊考虑点设计研究/试验方案。

在对应用纳米材料的医疗器械进行生物学评价时，如果纳米材料吸收和分布导致纳米材料的内部暴露、反应活性、代谢动力学或生物持久性发生改变时，可能触发进一步的试验，用于研究非常规的评价终点（如中枢神经系统、免疫系统功能终点）。

为了生成有效的毒理学数据用于应用纳米材料的医疗器械的风险识别和风险评估，更加高效地识别和评价特定风险，本指导原则提供了层级研究方法，用于逐步对应用纳米材料的医疗器械中与纳米材料相关的安全风险开展识别和评估。

层级1：注册申请人应根据医疗器械已有信息（GB/T 16886.1）和理化表征结果判断终产品中是否有纳米材料，若判断无纳米材料，则按照常规医疗器械的生物相容性/毒理学评价研究流程进行；若判断有纳米材料，则收集纳米材料的暴露可能性、表界面生物效应等信息，必要时开展纳米材料脱落和释放研究（参见本系列指导原则第二部分：理化表征）、与接触部位的表界面生物效应研究。基于所收集信息，可参考以下路径进行应用纳米材料的医疗器械的生物相容性/毒理学评价：

（1）若无纳米材料暴露可能性且接触部位无纳米材料相关的表界面生物效应，则按照常规医疗器械的生物相容性/毒理学评价研究流程进行；

（2）若缺乏评估纳米材料暴露的可能性的方法，或难以排除暴露可能性，或试验结果证明有暴露可能性，则进行层级2的研究。

（3）若接触部位存在与纳米材料相关的表界面生物效应，则进行层级2的研究。

基于当前科学技术水平和认知，评估应用纳米材料的医疗器械中纳米材料暴露可能性和与接触部位表界面生物效应的评价方法和技术手段还不够完善，鼓励注册申请人根据应用纳米材料的医疗器械的特性，基于个案处理原则对纳米材料的脱落和释放、与接触部位的表界面生物效应进行研究，保证试验方法、检测技术等因素的可靠性，并持续更新。

层级2：对于仅在接触部位有暴露或生物效应的应用纳米材料的医疗器械，主要考察与局部效应相关的试验终点，必要时进行毒代动力学研究，考察局部组织分布特征，还应关注纳米材料向引流淋巴结迁移及进入血液引发全身效应的风险；对于有潜在全身暴露或全身效应的应用纳米材料的医疗器械，主要针对常规评价终点进行研究/试验，同时增加特殊指标的检测，考察是否有潜在的特殊毒性风险，如免疫毒性、中枢神经系统毒性等，并进行毒代动力学研究，考察主要组织器官的分布、蓄积和清除特性，来决定是否有必要进行深入研究。

层级2的步骤如下：参考GB/T 16886.1附录A选择评价终点，并按照应用纳米材料的医疗器械评价要求设计试验，具体参见本指导原则附件一。GB/T 16886.1附录A列出了一个制定生物学评价的框架，除适用于常规医疗器械外，也适用于应用纳米材料的医疗器械。但由于纳米材料或纳米结构可能引发非预期的生物学效应，若已有信息或数据证明应用纳米材料的医疗器械在某些生物学评价终点有额外的安全风险考虑点，可在层级2开展相关研究。因此，注册申请人应结合纳米材料的纳米特性及暴露特征，基于个案处理的原则，提供评价终点选择的理由，并阐述评价终点选择的科学性和合理性。

以下内容为纳米材料生物相容性与常规材料生物相容性研究差异性的举例，具体内容详见附件一：

Ÿ 细胞毒性：根据细胞摄取纳米材料的能力，以及纳米材料与细胞的相互作用模式考虑需增加的试验。采用合适的细胞来测试纳米材料在靶器官、接触部位细胞、免疫细胞的摄取及生物效应，如肝、肾为潜在靶器官时，可选择HepG2人源肝癌细胞、LLC-PK1猪肾近曲小管细胞等进行试验。

Ÿ 致敏反应：若纳米材料具备一定的透皮性或局部反应风险，仅进行GPMT试验不足以评价纳米材料的致敏反应，可考虑增加体外替代方法并验证方法的适用性，如直接肽反应性测定法（DPRA）、人细胞系激活试验（H-CLAT）、KeratinoSens和SenCeeTox等方法。

Ÿ 亚慢性全身毒性：该试验建议增加附加毒性终点相关检测指标，如生殖系统毒性、中枢神经系统毒性、免疫毒性、内分泌系统毒性等终点的相关敏感指标的检测。

慢性毒性、致癌性、生殖/发育毒性、中枢神经系统毒性、免疫毒性、内分泌干扰等附加毒性终点一般不作为层级2的首批评价终点，但需在层级2的其他试验中增加与上述终点相关的敏感指标的检测，作为是否进入层级3的依据，如在亚慢性全身毒性试验中增加中枢神经系统的功能观察组合指标的检测，考察应用纳米材料的医疗器械是否有潜在中枢神经系统毒性。

若层级2的研究结果未发现附加毒性终点相关毒性指征的改变，一般无需进入层级3的研究，而是考察层级2的研究结果是否足以进行生物相容性/毒理学风险评估，若研究结果不足以进行生物相容性/毒理学风险评估，则需修正试验条件重复层级2相关研究内容，直至完成生物学评价，或根据研究结果停止生物学评价研究。

若层级2研究结果提示明确的附加毒性终点相关毒性指征，则进入层级3的研究。这些毒性指征包括但不限于纳米材料存在消除缓慢、在特定的组织器官内有蓄积的潜力、需要更长时间的代谢数据，或毒性特征提示需要关注特定组织/器官的毒性等。此外，若已有信息或数据证明应用纳米材料的医疗器械存在生殖系统毒性、免疫毒性等安全性风险时，可考虑直接进行层级3的相关研究。

层级3：是对层级2中发现的应用纳米材料的医疗器械附加毒性终点相关毒性指征发生明显改变时，开展与毒性指征相对应的全面的特殊试验，如生殖/发育毒性试验、致癌性试验、免疫毒性试验、中枢神经系统毒性试验、或内分泌干扰试验等，参见本指导原则附件一，同时伴随相应试验开展毒代动力学研究，考察所关注的特殊组织器官中纳米材料暴露、分布和蓄积特征。注册申请人应结合纳米材料的纳米特性及暴露特征，基于个案处理的原则，提供评价终点选择的理由，并阐述评价终点选择的科学性和合理性。

完成层级3的研究后，结合层级2和层级3的研究结果考察是否足以进行生物相容性/毒理学风险评估。若层级2、层级3的研究结果足以进行生物相容性/毒理学风险评估，不必再进行其他试验；否则应重复层级2或层级3的相应研究内容，直至完成生物学评价，或根据研究结果停止生物学评价研究。

图1 医疗器械中与应用纳米材料相关的风险识别和风险评估的层级评价方法流程图

a.现有GB/T 16886.1 附录A，以及ISO/TR 10993.22（等同转化为GB/Z 16886.22）所提供的框架用于应用纳米材料的医疗器械的生物相容性/毒理学评价是有限的，需要结合其纳米特性和暴露特征考虑增加评价终点。

b.如层级2研究结果提示应用纳米材料的医疗器械存在安全性风险，如蓄积、特定器官或系统毒性、则在层级3中针对层级2的发现进行进一步研究。如层级2中发现生殖器官有纳米材料分布，应在层级3中开展对生殖功能影响等毒性试验，并进行伴随毒代动力学，考察所关注的特殊组织器官、关键组织器官中纳米材料暴露、分布和蓄积特征。

c.如果出现以下情况，需要考虑重复进行层级2或层级3相关试验研究，如完善试验设计、试验结果存在争议、试验结果提示需要补充研究内容等。

d.完成生物学评价后，可进行产品的获益-风险评价，或者停止生物学评价，对产品重新进行研究和开发。

三、生物相容性/毒理学评价

（一）引言

对应用纳米材料的医疗器械的生物相容性/毒理学的评价包括文献综述、生物信息学、体外和体内试验等一系列研究。对于医疗器械，任何试验的选择策略均基于其预期用途/适用范围。体内研究应采用与医疗器械和/或纳米材料人体暴露途径相关的接触途径进行。所有试验均应按照现行/有效的最佳实验室/治疗规范进行，数据应由经过培训且有经验的专业人员进行分析解读。对应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价应依据以下原则：

1.进行多层级评价研究原则

应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学测试策略由其潜在外部和内部暴露特征决定。当理化表征、暴露评估等确定医疗器械有纳米材料暴露的可能性时或相关表界面生物效应时，除按照GB/T 16886系列国家标准、GB/T 42062通用要求进行相应的试验外，还应基于纳米材料风险评估的要求，参考GB/T 37129、GB/Z 16886.22，按照与纳米材料相关的风险识别和风险评估的层级评价方法流程图进行多层级评价研究，考虑是否增加额外毒性关注指标，以及深入开展附加毒性试验。

2.遵循个案处理原则

按照GB/T 16886.1的要求，医疗器械的生物学评价试验策略均应基于医疗器械分类、接触性质和暴露持续时间等进行考虑。由于应用纳米材料的医疗器械情况复杂，本指导原则不可能涵盖所有应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价的全部内容。针对某一具体产品，其生物相容性/毒理学评价应遵循个案处理的原则。

3.确认测试系统的适用性原则

纳米材料的溶解或分散状态、样品制备方法、剂量设计、细胞品系、动物种属等测试系统参数都可能影响试验结果的可靠性，故需确认测试系统是否适用于评价应用纳米材料的医疗器械，如样品制备方法不适用于应用纳米材料的医疗器械时，可考虑直接使用医疗器械终产品或代表性样品进行相关试验。目前可用于应用纳米材料的医疗器械生物学评价的专属试验方法尚在开发中，可参考的试验方法较少，已发布并正式实施的相关标准主要包括内毒素试验（YY/T 1295）、细胞毒性试验（GB/T 41212、GB/T 41915、YY/T 0993）、体外溶血试验（YY/T 1532）。因此，注册申请人应确认测试系统的适用性，提供适合所申报产品特点的生物学评价资料。一些体外试验可能对于筛选目的及作用机制的研究是有用的，但这些方法的使用必须基于个案处理原则。目前经过确认的体外方法参见欧洲替代方法验证中心（EURL ECVAM）发布的方法。

4.生物组织中纳米材料的表征原则

纳米材料和生物组织中的生物分子相互作用可能获得新“生物学特征”，即在表面吸附蛋白质等生物分子（蛋白冠、生物冠）时产生的新性质，可影响机体的生理响应及毒理学特征。因此，纳米材料在试验条件下的实际存在形式、特性和稳定性等信息对于任何试验结果的解释都是至关重要的。应在试验开始和结束时（若可行）对生物组织中的纳米材料进行表征。

5.毒代动力学数据判定原则

证明纳米材料在细胞和/或组织中有暴露是解释研究结果的关键（特别是阴性结果），缺乏这类数据对得出最终结论可能造成很大的不确定性。因此，在技术可行的情况下，应确定纳米材料是否分布在组织或细胞的特定区域，明确在试验系统中的暴露量。

（二）应用纳米材料的医疗器械生物学评价试验的核心关注点

1.样品制备

溶解和分散：纳米材料与溶解的化学物质不同，通常为不溶或部分溶解的纳米颗粒以混悬/分散和/或更大的团聚和聚集状态存在。试验介质/制剂（及其成分）可能影响纳米材料的特性和性能。当采用体内或体外方法对不溶或部分溶解纳米颗粒进行测试时，一定要重点考虑纳米材料在介质中的分散状态。

样品制备：取样和样品制备通常是整个分析过程中至关重要的步骤，也可能是结果不确定性的最大来源。纳米材料样品制备中的一个关键问题是颗粒的适当分散。目前尚无专门应对纳米材料样品制备的标准文件，注册申请人可参考GB/T 16886.12提供的样品制备通用要求进行样品制备。此外，建议注册申请人对样品制备的分散情况和稳定性进行测试并记录。

2.浓度/剂量

纳米材料浓度/剂量可能因其团聚、聚集、沉淀、与介质中的物质结合，或吸附在容器上而降低。为了确保在试验期间使用的浓度/剂量保持稳定，任何体内、体外毒性试验应特别关注纳米材料的团聚/聚集、解聚和重聚集行为，以及纳米材料的不溶/部分溶解性质，考察纳米材料在试验介质中的稳定性和均一性，以确保所用的纳米材料的浓度/剂量与预期一致。

此外，在一些试验中，使用过高的浓度或剂量可能会改变纳米材料的物理化学特性（如形成团聚体等次级粒子），导致吸收、毒性降低，甚至获得与材料固有毒性无关的结果，如吸入研究中过度负荷剂量、遗传毒性中过高浓度导致细胞毒性等。因此，申请人应提供选择高浓度或剂量的依据和理由。

3.剂量单位

常规材料通常使用重量或体积剂量单位进行检测、表示以及风险评估（例如mg/kg，或mg/L）。然而，对于纳米材料来说，潜在生物相互作用不直接依赖于分子的浓度或数量，而依赖于纳米材料/纳米物体本身。纳米毒理学的剂量-反应关系可能与纳米物体数量或表面积等纳米特征参数更相关。因此，使用比表面积、颗粒数量等剂量单位描述纳米材料的剂量-反应关系可能更加合适。也可使用纳米材料表征中得出的其他参数来表示剂量。在合适的参数识别出来之前，重要的是描述不同的剂量度量，如质量-体积浓度、颗粒数量浓度、比表面积等，为基于质量的剂量换算成其他参数提供足够的信息。

4.对试验系统的干扰

内毒素的干扰：纳米材料分散体系中存在的内毒素可能干扰试验系统，并随试验系统的不同导致假阴性或假阳性结果。

对基于光学原理试验方法的干扰：纳米材料可能与试验系统或试剂相互作用，特别是在比色试验中（例如用于细胞活性试验的磺酰罗丹明B，或MTT）。另外，一些纳米材料本身对光有散射/吸收，也可能干扰比色试验测定。这些因素需要在使用比色方法时加以考虑。

与生物分子作用：试验系统中的蛋白质/生物介质（如细胞因子）也可能吸附到纳米材料表面，造成低响应甚至是假阴性结果。

对于此类问题，建议增加合适的对照品或对现有方法进行调整。例如，纳米材料已被证明可干扰基于四唑化合物的试验，如MTS和MTT法的吸光度检测。可在读数前通过离心除去纳米材料，以降低由纳米材料产生的数据变异度。

5.可能的毒性机制

解离离子的毒性：一些金属（银）、金属氧化物（氧化锌）或无机非金属/陶瓷材料在生物介质中会（缓慢）溶解/降解，检测的部分（或全部）毒性效应可能都源于溶解/降解产生的离子。对于这类纳米材料，应在试验之前和试验期间测定溶解/降解的部分所占比例，并增加合适的离子形式对照组。

与尺寸相关的毒性：纳米材料的毒性可能源自其尺寸效应，易于进入生物系统，被炎性细胞吞噬，特别是巨噬细胞和多核嗜中性粒细胞。纳米材料可吸附蛋白质和多肽形成新的蛋白质复合物，或改变蛋白质结构，促进蛋白质降解，触发炎性细胞的应答过程。因此，应关注尺寸效应与毒性的相关性，以进行风险评估。

纳米材料形貌对吞噬作用的影响：纳米材料的软硬度、刚性、拓扑结构对细胞摄取、细胞内定位、细胞内吞机制均具有影响。例如，球状纳米颗粒被细胞内吞的过程比棒状或纤维状纳米材料容易和迅速。对于这类纳米材料，应关注不同纳米形貌结构对细胞摄取与毒性的影响。

（三）生物相容性/毒理学试验

本指导原则旨在为经过培训的专业人员提供在医疗器械评价方面对应用纳米材料的医疗器械进行生物相容性/毒理学评价的通用方法，并在附件一中讨论如何基于GB/T 16886系列标准文件、GB/Z 16886.22，及应用纳米材料的医疗器械特殊考虑点来设计试验，包括试验设计、细胞/动物模型选择、研究终点选择、结果解释等内容。

本指导原则代表了现有认知水平下监管部门对应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价终点的考虑及应对措施，未来随着毒理学和纳米材料转归方面的认知增长，更多试验方法的缺陷可能会显现出来，本指导原则的内容将随着纳米材料生物相容性/毒理学评价研究的不断推进而完善。因此，建议注册申请人关注研究最新进展，并在开展应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价时加以考虑，以保持对应用纳米材料的医疗器械生物学评价最新技术的持续更新。

四、参考文献

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五、编写单位

本指导原则由国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心牵头，国家纳米科学中心、广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院、山东省医疗器械和药品包装检验研究院、中国食品药品检定研究院参与编写，由国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心负责解释。

附件一 应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学研究相关内容

（一）细胞毒性试验

作为生物相容性/毒理学评价的一部分，细胞毒性试验的结果可以作为纳米材料潜在暴露和危害的证据，并确定其作用机制，有助于体内试验的设计和解释。可按照GB/T 16886.5、YY/T 0993和ASTM E2526的要求，根据已有的数据和暴露信息合理开展应用纳米材料的医疗器械的细胞毒性试验。

纳米材料的细胞毒性依赖于细胞对其敏感性、特定受体的存在或摄取机制。纳米材料可通过氧化应激诱导细胞毒性，并在进入细胞后与细胞内不同成分相互作用并干扰细胞功能。此外，纳米材料也可能通过离子释放引起细胞毒性。根据应用纳米材料的医疗器械的预期接触部位和可能接触的细胞类型，一般可选择非吞噬性细胞（如3T3小鼠成纤维细胞，L929小鼠成纤维细胞，HaCaT人源角质形成细胞）和吞噬性细胞（如RAW264.7 小鼠巨噬细胞，THP-1人源已分化巨噬细胞）进行试验。为了获得纳米材料的危害和作用模式信息、以及暴露情况，鼓励注册申请人在能力可及范围内测试有代表性的靶组织部位细胞、接触部位细胞、免疫细胞等类型。

可以考虑的特定终点包括细胞活力/细胞毒性（MTT、MTS、LDH法等）、氧化应激反应、DNA合成（BrdU法）、能量代谢（测定ATP）、（促）炎症反应（作为免疫毒性的一部分）和组织屏障穿透性等。如适用时，可考虑直接接触法评价应用纳米材料的医疗器械的细胞毒性。

（二）遗传毒性试验

应用纳米材料的医疗器械的遗传毒性试验应遵循医疗器械GB/T 16886.1、GB/T 16886.3的一般性原则，建议结合纳米材料的特性，以遗传毒性标准组合试验为基础开展遗传毒性评价，遗传毒性评价方法选择可参考GB/T 16886.3。

细胞对纳米材料的摄取能力是影响其体外遗传毒性评价结果的关键因素。细菌回复突变试验可能不适合检测某些具有抑菌性或无法进入细菌内的纳米材料。体外哺乳动物细胞试验建议使用可摄取纳米材料的细胞系，试验设计时应考虑到纳米材料在细胞内发挥作用的浓度和作用时间，并对细胞摄取纳米材料的能力进行分析。

如果至少有一项体外遗传毒性试验结果阳性，可参考GB/T 16886.3附录B中的后续评价流程图选择适宜的体内试验评价其遗传毒性风险。应根据最常见的体内暴露途径选择适宜的体内试验暴露方式，并需通过适当方式确定纳米材料在检测组织中有一定暴露且不会被快速清除。

（三）急性毒性

医疗器械急性毒性试验相关标准（GB/T 16886.11、GB/T 16886.12）的一般要求也适用于应用纳米材料的医疗器械。样品制备时，应说明分散体系选择的合理性。GB/T 16886.11以外的急性毒性试验信息可以在下述标准中找到：急性经口毒性试验固定剂量法（GB/T 21804），急性毒性分类方法（GB/T 21757），或者上下增减剂量法（GB/T 21826）。吸入途径急性毒性分级方法在GB/T 21605和GB/T 28648中描述，体内急性皮肤毒性试验在GB/T 21606及 GB/T 21604中描述。

（四）刺激性

纳米材料的生物效应可能导致其穿透皮肤、眼睛或黏膜以及被摄取，应考虑适宜的模型评价纳米材料的刺激性。GB/T 16886.23的一般要求也适用于纳米材料。此外，当局部组织生理状态改变时，如分泌汗液的皮肤、机械损伤的表面、病理学病症、光损伤等，对纳米材料的屏障效应也可能发生相应改变，导致不同的刺激性。因此，选择的试验方法应能充分模拟应用纳米材料的医疗器械的临床具体使用条件和暴露途径。

已有一些体外替代试验（如大鼠皮肤经皮电阻抗试验，OECD 430；EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™, EST-1000，OECD 431）被验证用于评价化学品的刺激性。若注册申请人采用体外替代方法进行纳米材料的医疗器械刺激性试验时，需要提供详细的研究资料和验证资料。关于体外替代方法的相关内容，将在本系列指导原则第五部分：体外替代测试方法/计算机模拟研究中给出。

（五）皮肤致敏反应

纳米材料的大比表面积，类佐剂效应以及与蛋白质形成的复合物都可能会导致过敏。GB/T 16886.10描述了评估医疗器械及其成分诱发皮肤致敏反应的试验方法，即鼠科动物局部淋巴结测定（LLNA）、豚鼠最大剂量试验（GPMT），以及封闭式贴敷试验。由于纳米材料的低皮肤穿透性，LLNA和封闭式贴敷试验可能检测不出致敏潜力，阴性试验结果不能被解释为纳米材料无致敏性。GPMT试验尽管局部诱导期和激发均使用完整皮肤，但由于首次诱导为皮内途径，可能是目前检测纳米材料致敏性最相关的试验。

目前，采用GPMT试验评价纳米材料的实验数据非常有限。基于现有知识，不能依赖单一特定的试验方法来研究纳米材料。可以优先考虑GPMT法，再结合个案分析原则，确定最终的试验组合。建议注册申请人根据应用纳米材料的医疗器械特性，基于个案分析的原则，选择适用的试验方法，并保持试验方法的持续更新。

（六）血液相容性

目前缺乏专用于评价与血液直接或间接接触的应用纳米材料的医疗器械血液相容性的标准方法，体外条件下的溶血、血液学、凝血、血小板激活和补体激活试验均可以为纳米材料血液相容性提供有效的参考。

对于表面具有纳米材料/纳米特征的医疗器械，可直接按照GB/T 16886.4开展血液相容性评价，推荐以器械表面积/血液体积的比例计算接触体系。由于游离纳米材料比常规材料有更高的比表面积，其血液相容性评价更具有挑战性，在参考GB/T 16886.4、YY/T 1532进行试验时，需特别关注纳米材料特性对其进入血液后的级联反应的影响，以及纳米材料在介质中的表征结果。

若体外试验不足以评价纳米材料的血液相容性，可考虑结合体内试验进行评价，将纳米材料注射到循环系统并评价其分布以及任何局部和全身不良反应，如血管损害、血液学、血生化相关指标的改变，并参考GB/T 16886.4进行补体激活、凝血级联激活、血小板激活等试验评价纳米材料的血液相容性。

除了血液相容性常规项目外，建议考虑纳米材料与吞噬细胞的潜在相互作用。目前尚无评价纳米材料与吞噬细胞相互作用的标准方法。推荐增加内皮细胞和/或单核细胞激活评估（如评价细胞黏附分子标志物、促炎因子、促凝因子等）。

此外，新技术（如微流控）可能用于评价纳米材料与内皮细胞和/或血管的相互作用。

（七）毒代动力学

1. 引言

GB/T 16886.16的一般性原则也适用于应用纳米材料的医疗器械。与常规材料不同，组织器官可能快速摄取纳米材料而不依赖于其在血液中的浓度。纳米材料在组织中的分布、蓄积以及消除可能比在血浆中的暴露特征更能代表真实的暴露情况，尤其是在典型的摄取器官、靶器官中的分布情况，如肝、脾、肺等。另外，多次接触可能导致纳米材料在一些组织器官中蓄积和长期保留，应重点考察纳米材料在组织器官中的分布、蓄积和消除特征。此外，肾可能是纳米材料排泄的重要器官。为了识别纳米材料的组织分布、蓄积和滞留潜力，有必要设计单次和多次接触的毒代动力学研究，并合理延长样本采集时间点。

接触途径可能影响纳米材料的动力学特征。如当气管内接触金纳米颗粒（1.4 nm）时，肾脏暴露量比肝更高，而采用静脉接触后，肝成为最主要的靶器官。应用纳米材料的医疗器械表面分子粘附，不仅影响纳米材料的脱落和释放，还可能促进单核巨噬细胞系统（MPS）对纳米材料的识别和摄取，以及经淋巴系统迁移或转运，以及二次组织分布。如果从医疗器械中释放的纳米材料可能被吸收、分布、代谢和/或排泄，即需要进行毒代动力学研究。

2. 纳米材料毒代动力学研究方法

开展应用纳米材料的医疗器械的毒代动力学研究时，建议基于层级评价流程（正文第三部分）逐步进行。在层级1中，收集纳米材料暴露信息，必要时开展应用纳米材料医疗器械的脱落和释放体外和/或体内试验,进行纳米材料的暴露可能性评估。在层级2中，可在其他试验中增加卫星组进行伴随毒代动力学研究或单独开展毒代动力学研究，考察纳米材料在主要组织器官中的分布、蓄积和清除特性。在层级3中，通常伴随其它试验开展毒代动力学研究，考察纳米材料在特殊组织器官中的分布、蓄积和消除特性，如伴随生殖/发育毒性试验开展毒代动力学研究，对胎盘、乳汁中的纳米材料进行定性和定量分析。

定量分析方法一般可采用元素分析法对纳米材料化学组成进行定量分析，如电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、原子吸收光谱-质谱法（AAS-MS）等。现有的检测方法中，含金属元素的纳米材料相比于其他纳米材料更容易被检测。但检测出特定的元素并不能证明材料以纳米形式存在，还需进行纳米材料的定性分析，可参考本系列指导原则第二部分：理化表征。具体研究时，建议先采用定量分析方法对样品中的元素进行检测，若有特征元素存在，再采用纳米材料特异性的方法进行定性分析，考察化合物是否以纳米形式存在。

放射性同位素或荧光染料标记方法可用于标记纳米材料，跟踪纳米材料的生物转化和生物转运过程，测定生物样品中母体物质和代谢物的总量。但某些标记可能引起纳米材料的表面化学变化，从纳米材料中脱离，干扰毒代动力学研究。因此，当使用标记技术时，需要考察标记-纳米材料组合物的完整性，以及对毒代动力学特征和毒性的影响，评估方法的可用性和安全性，确保标记物在接触和进入体内后按预期发挥作用，且不改变纳米材料的毒代动力学行为。

3.不同接触途径的应用纳米材料的医疗器械毒代动力学关注点

（1）经皮肤接触途径：应关注皮肤损伤状态，以及溶剂和载体效应等因素，对纳米材料穿透皮肤角质层和吸收的影响。

（2）非经皮肤接触途径：

a.眼暴露摄入：纳米材料可能到达眼部深处组织，应关注纳米材料在眼部的释放和代谢动力学数据。

b.呼吸道暴露摄入：纳米材料除暴露于肺部，也可能存在全身暴露的情况，肺部清除的半衰期可能高达2个月，应关注全身暴露可能性，及缓慢清除特征。

c.经消化道暴露摄入：纳米材料在消化道暴露的量通常较低，但小尺寸纳米材料可能被摄取，应关注纳米材料粒径对暴露的影响，可以使用胃肠道体外模型来研究纳米材料在肠道的转运。

d.皮下暴露摄入（植入物）：可以通过皮下注射作为经皮植入分布研究的替代方法，并关注纳米材料在淋巴结、肝、脾和肺等器官的颗粒团聚现象。

（八）热原

由于纳米材料表面极易吸附微生物及其产生的细菌内毒素（LPS），干扰纳米材料与生物系统之间的相互作用，增加热原反应风险。应用纳米材料的医疗器械细菌内毒素检测可参考YY/T 1295给出的试验方法进行。除细菌内毒素介导的致热性外，也需考虑纳米材料介导的致热性，可参考GB/T 16886.11给出的试验方法进行测试。

（九）植入

GB/T 16886.6中提供了不同组织（皮下、肌肉、骨、脑）局部植入的标准方法，也适用于降解和非降解纳米材料、固体和非固体纳米材料如多孔材料、液体、凝胶、膏状和粉末等不同形态。

对于非降解纳米材料，短期反应评估一般为1周至4周，长期反应评估则一般超过12周。在肌肉和结缔组织中，植入后9周至12周时细胞群呈稳定状态，在骨组织中，则可能需要较长的观察期才能达到稳定状态，须基于个案处理原则。而对于可降解材料，组织反应的稳定状态通常取决于纳米材料在组织中的降解特性。纳米材料在降解过程中可能与局部组织持续发生相互作用，故需要监测更多的观察周期以覆盖典型的组织变化节点，还应关注所产生纳米颗粒在局部沉积引起的局部组织学效应，以及向引流淋巴结迁移及进入血液引发全身效应的风险。

尽管GB/T 16886.6不用于全身毒性、致癌性、致畸性或致突变性的评估，但如果在植入研究过程中，同步满足了GB/T 16886.11全身毒性的要求，则可以进行局部反应和全身反应的联合研究。

（十）亚慢性毒性试验

GB/T 16886.11中提供了医疗器械在适当的暴露途径和时间的多次接触毒性试验方法。由于医疗器械涉及的材料类型多、形态复杂、预期用途范围广等特点，故在全身毒性试验设计中应根据纳米材料的特性考虑特定的方法。

应当考虑临床预期用途/适用范围、终产品状态、暴露特征等因素，在最恰当的条件下开展亚慢性毒性试验，以便模拟人体暴露情况。如直接应用终产品不可行，应使用终产品的代表性样品进行测试。

短期的亚慢性毒性试验可提供初步的剂量探索和毒代动力学数据，用以发现重点关注的靶器官。亚慢性毒性试验可设置卫星组进行伴随毒代动力学研究，也可单独开展毒代动力学研究。对于经血液接触的应用纳米材料的医疗器械，最低要求是改良的28天毒性试验，对于其他途径接触的应用纳米材料的医疗器械，最低要求是改良90天毒性试验，并应根据所研究的纳米材料特性及临床接触时间，评估28天或90天试验是否足够。在该试验中，除了关注一般全身毒性反应外，还应重点关注心血管系统（如纳米尺度团聚物在血管内形成）、炎症指标、涉及吞噬系统的组织/器官（如肝、脾、肾、骨髓和肺等），以及需要尽可能评估纳米材料的潜在神经毒性、免疫毒性、生殖毒性或内分泌介导效应，进行初步危害表征和危害评估，为风险评估提供信息，为进一步深入研究提供依据。与组织、器官存在长期、持久接触的应用纳米材料的医疗器械，需要重点关注接触组织、器官的潜在毒性风险，如与生殖器官、胚胎或胎儿长期或持久接触的应用纳米材料的医疗器械，可能需要重点关注潜在的生殖发育毒性风险。

（十一）需要附加考虑的试验

1. 慢性毒性/致癌性试验

慢性毒性试验：GB/T 16886.11的一般性原则也适用于应用纳米材料的医疗器械，建议结合纳米材料特性进行试验。

致癌性试验：GB/T 16886.3描述了致癌性试验的一般要求。医疗器械中使用的常规材料已经有相关知识，很少考虑开展致癌性研究，而纳米材料的相关信息有限，应基于个案处理原则进行试验。若应用纳米材料的医疗器械遗传毒性试验阳性，降解周期超过30天或与人体持久接触时，应结合纳米材料和/或其浸提物潜在暴露信息、人体使用史等论证开展致癌性试验的必要性和合理性。

最常见的评估化学品致癌潜力的体内试验是：

a) 致癌性试验 [EC B.32, OECD 451]；

b) 慢性毒性/致癌性联合试验 [EC B.33, OECD 453]；

慢性毒性和致癌性研究一般是在单一物种中进行，通常选择大鼠，可以单独进行研究，也可联合进行，若联合研究，应特别注意剂量是合适的，确保到研究终点时存活动物的数据可进行统计分析。当首选物种出现可疑结果或者特定发现，或需要专门研究所观察到的毒性或者致癌性的作用机制时，则需要进行第二个物种的致癌性研究。

2. 生殖和发育毒性试验

GB/T 16886.3关于生殖和发育毒性的策略也适用于应用纳米材料的医疗器械。

亚慢性毒性试验及毒代动力学研究可获得应用纳米材料的医疗器械的生殖系统毒性信息，如对生殖器官的影响、生殖器官中纳米材料分布和蓄积等特征、动情周期（如果需要）、性激素（如果需要）的影响等，但不能评估对生育力和整个生殖周期（从性成熟到受孕、妊娠、分娩和分娩后发育）的影响，即发育毒性。建议根据层级2中改良亚慢性毒性试验的毒性特征及暴露情况，综合考虑是否在层级3中开展生殖和发育毒性试验。若应用纳米材料的医疗器械已有信息显示具有一定生殖和发育毒性风险，需要进行试验，可先进行OECD 421，以提供可能影响生殖和（或）发育的初步信息。

在缺乏证据可以排除生殖/发育风险的情况下，应考虑进行生殖和发育毒性试验。需按照OECD 414 （胎儿发育毒性试验）, OECD 415 （一代生殖毒性试验）, OECD 416 （二代生殖毒性试验）开展试验，并对方法的适用性进行个案处理。

若需评价子代发育毒性，可在一代生殖毒性试验中结合生殖系统发育、神经系统发育和行为学研究、免疫系统发育、内分泌研究等数个毒性终点，评估妊娠期、哺乳期和青春期的暴露对生育和生殖功能的短期到长期的影响，以及对离乳前仔代和离乳后仔代的影响。当需要充分表征人体暴露风险时，可能需要考虑评估到F2代。

生殖/发育毒性试验注意事项：

a. 一般使用临床暴露途径，并基于个案分析原则，考虑暴露途径的可行性。如宫内节育器等医疗器械，若直接采用临床暴露途径可能会影响动物受孕以及胎仔发育；腹膜内接触可能导致纳米材料直接注射到子宫或穿过子宫壁，影响发育中的胚胎/胎儿；压力环境及每天超过6小时不进食水，导致经鼻吸入暴露途径不适用于怀孕雌性动物。

b.建议尽可能开展伴随毒代动力学研究，如在发育毒性研究中，纳米材料可能经母乳暴露于子代，故应对母乳中纳米材料进行定性和定量分析。

3. 免疫毒性

免疫反应在层级2的研究中可能会被扩大或首次出现，评价纳米材料对免疫系统的作用可以基于层级2中的试验结果对免疫毒性进行综合评估，在个案处理原则上考虑层级3的试验内容。

在亚慢性和慢性毒性试验中，通常提供血液学和血生化数据，以及脾细胞和/或骨髓细胞的表型分析（T-、B-、NK细胞）。EOGRTS试验需设置额外的组用于评估暴露对免疫系统发育的潜在影响，并提供免疫球蛋白IgM对T细胞依赖抗原（如绵羊红细胞(SRBC)或血蓝蛋白 (KLH)）反应的信息。

如果需要进一步评估应用纳米材料的医疗器械的免疫毒性，可采用体外模型评估免疫细胞的吞噬功能、趋化性、炎性因子、一氧化氮产生和信号通路等指标。建议采用证据权重方法综合评估应用纳米材料的医疗器械的免疫毒性风险。

4. 神经毒性

应用纳米材料的医疗器械的潜在神经毒性信息可从改良的亚慢性毒性试验中获得，相关指标包括临床体征的改变、功能性观察组合试验（FOB）和自主活动、脑脏器系数（在没有明显毒性的情况下），以及神经系统组织病理学改变等，如有必要，可增加神经递质、神经元结构及炎症因子等指标。其他如体外神经毒性试验、交叉参照或提示具有神经毒性潜能的物理化学性质等信息也应予以综合考虑。

层级2发现潜在神经毒性时，应基于个案处理原则考虑在层级3进行深入的神经毒性试验，从而确认或表征纳米材料诱发的神经毒性反应。在设计这些研究时也应充分考虑其他试验的信息，以尽量减少全身毒性继发的效应。在完成风险评估时，还可以进行机制研究，以提高从动物到人体的外推把握度。

5. 内分泌介导效应

纳米材料可能对内分泌系统产生不利影响，特别是对生殖系统，可能改变激素水平，还可能具有性别差异。改良的亚慢性毒性试验可用于研究内分泌干扰效应，应关注内分泌相关毒性终点（如甲状腺激素的测定、内分泌系统相关的大体解剖检查和组织病理学检查、动情周期检查等）。