微生物来源药物制备工艺研究中质量控制要素探讨（二）--发酵工艺的过程控制

审评三部张哲峰

与化学合成方法相比，微生物发酵制备工艺有其不同特点，原本在反应釜中进行的化学反应成为在菌体内通过菌体的初级或次级代谢等生命过程完成，也就是说，微生物发酵过程是生物细胞按照生命固有的遗传信息，在所处的营养和培养条件下，进行的复杂而细微的各种动态生化反应集合，对这些代谢过程难以如同调控化学反应一样实施精细、准确的监控，只能在研究菌体的发育、生长和代谢等生命过程，以及各种生物、理化和工程环境因素对这些过程影响的基础上，通过对菌种、发酵条件和工艺过程的控制来把握产品质量，与直接调控化学反应相比，这种“间接”的过程控制方式在把握药品质量方面具有相对较大的风险和难度。微生物发酵过程的工艺参数对于终产品的杂质、组份乃至主成分结构等质量特征以及产品收率具有明显影响，因此，科学可行的过程控制措施是此类药物研发的重要内容之一。
微生物发酵是在一定条件下进行的，由于发酵过程的复杂性，实现药品质量的过程控制较化学合成反应的复杂程度要大，特别是控制抗生素等次级代谢产物的发酵就更为困难，因为微生物细胞在发酵过程中要进行上百个酶反应，并受到各式各样的调控机制的影响，它们之间还会相互制约，如果某个反应受阻，有可能影响整个代谢的变化，因此，有时外界因素的微小变化即对目标物的生成产生显著影响，因此，研究菌体的培养规律、探讨生产菌对环境条件的要求和代谢变化的规律十分必要，通过调控与发酵条件和微生物细胞代谢变化有关的各项参数，来有效控制发酵过程，使生产菌的代谢变化按照人们需要的方向进行，达到预期目的。培养基的优化以及发酵工艺的过程控制对于保证产品质量十分重要，通常调控的与微生物发酵有关的参数可分为物理、化学和生物三类，另外，还要通过代谢曲线、对次级代谢进行调控以及发酵终点的判断等过程控制措施共同把握产品质量。
在生物合成工艺的各环节中，孢子制备是发酵工序的开端，将保藏的休眠状态的孢子通过严格的无菌操作接种到固体培养基上，在一定温度下培养后，进入种子制备工序，是制备工艺的重要环节；使孢子发芽繁殖以获得足够数量的菌丝以便接种到发酵罐是种子制备阶段的核心任务，需要在一定的空气流量、罐温、罐压等条件下培养，并定时取样通过无菌试验、菌丝形态观察和生化分析来确保种子质量；发酵工序是制备工艺的关键阶段，其主要目的是促使微生物分泌大量目标物，种子的接种量、通气量、罐温、罐压、搅拌速度等因素均是重要的工艺参数，发酵过程中还要定时取样分析和无菌试验，观察代谢情况、目标物含量以及有无杂菌污染，并根据检测情况，通过调节pH、消沫以及补充碳源、氮源和前体等措施促进目标物的生成。
1、培养基
培养基是人工配制的适于微生物生长、繁殖和积累代谢产物的营养基质，不同微生物对培养基的要求有所不同，同一微生物在不同阶段有不同的培养目的，需根据需要设计不同的培养基组成。按其用途一般可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基，为使工艺条件稳定，有利于生产菌生长和代谢，延长发酵周期，通常还要加入补料培养基。培养基是影响发酵水平的关键因素之一，确定一种合适的培养基系列需要大量而细致的工作，目前尚无成熟的原则，可根据生物化学、细胞生物学、微生物学的基本原理，参照同类菌种的经验配方，结合具体菌种和目标物的特点，采用小型发酵设备，对碳源、氮源、无机盐及前体等进行逐个单因子试验，或采用正交设计、均匀设计等数学模型考察各因子之间的交互作用，优化培养基的组成和比例，在此基础上综合考虑各因素的影响，得到较为合适的培养基系列。
2、控制发酵过程的物理参数
●温度：发酵的整个过程或不同阶段中所维持的温度，与生物合成的酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传质速率、菌体生长速率以及目标物的合成速率等密切相关。发酵过程中的温度，不仅影响菌体生长，还影响到代谢产物（目标物）的合成速率和方向。事实上，菌体的最适生长温度与目标物的最适生产温度往往不一致，因此，需要通过相应研究、综合权衡，选择适宜的发酵温度，申报资料中需要体现选择研究过程以及确定的适宜温度。
●压力：发酵过程中发酵罐维持的压力，与O2和CO2在培养液中的溶解度有关，间接影响菌体代谢。
●搅拌转速和搅拌功率：发酵过程中搅拌器的转动速度，影响氧容量及在培养液中的传质速率和发酵液的均匀性。
●空气流量：需氧发酵的控制参数，影响氧的传递和其它参数。
●黏度：可以作为细胞生长或细胞形态的一项指标，也可反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。既可影响氧的传质阻力，又可表示相对菌体浓度。
●浊度：可及时反映单细胞生长状况，对某些目标物的生产非常重要。
3、控制发酵过程的化学参数
●pH值：发酵液是发酵过程中各种产酸和产碱生化反应的综合结果，与菌体生长和发酵中的各种酶活甚至目标物的稳定性密切相关，因而影响目标物合成，是发酵参数控制的重要参数之一。对于不同微生物发酵有各自的最适生长pH和最适生产pH，合适的pH是根据试验确定的。申报资料需要体现选择研究过程、确定的适宜pH及其调控措施。
●基质浓度：发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度，其变化对生产菌的生长和目标物的合成有重要影响，也是提高目标物（代谢产物）产量的重要控制手段，控制基质的种类和用量是发酵能否成功的关键，需根据生产菌的特性和目标物生物合成的要求经过相应研究确定，发酵过程中要定时监控。申报资料中需要说明经研究确定的碳源、氮源及磷酸盐的种类、浓度的影响及其控制措施，除此之外，其它基质如Cu2＋、Mn2＋等有时对特点目标物的生物合成过程具有明显影响，也需进行相应研究并确定适宜参数。
●溶氧量：需氧菌发酵的必备条件和重要参数，溶氧大小对菌体生长和目标物的性质和产量都会产生不同影响。氧是微生物体内一系列细胞色素氧化酶催化产能反应的最终电子受体，也可作为某些目标物生物合成的基质，是表征发酵过程异常情况和设备供氧能力的重要中控参数，通过发酵液中溶氧量的变化，可以了解微生物生长代谢是否正常、工艺控制是否合理以及设备供氧能力是否正常等，因此是产品质量过程控制的重要参数。
●氧化还原电位：培养基的氧化还原电位是影响微生物生长及其生化活性的因素之一。培养基最适宜与所允许的最大电位值应与微生物种类和生理状态有关，常作为控制发酵过程的参数之一。
●目标物浓度：是目标物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数，也是决定发酵周期长短的重要根据。
●废气中的[O2]和[CO2]:可以推算生产菌的摄氧率、呼吸熵、发酵罐的供氧能力，从而了解生产菌的呼吸代谢规律。
4、控制发酵过程的生物参数：
●菌丝形态：丝状菌发酵过程中菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映，可以作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据。
●菌体浓度：是控制微生物发酵的重要参数之一，在一定条件下不仅反映菌体细胞多少而且反映菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段，特别是对抗生素等次级代谢产物的发酵，菌浓的大小和变化速率对菌体的生化反应都有影响。发酵过程中，需要根据不同的生产菌和目标物，采取相应措施控制菌浓在合适范围内。
5、代谢曲线
根据发酵过程中参数变化绘制的次级代谢的代谢曲线，可以明晰发酵过程中的代谢变化，并反映出碳源、氮源的利用pH、菌体浓度和目标物浓度等参数之间的相互关系，分析研究代谢曲线有利于掌握发酵代谢变化的规律便于采取相应的过程控制措施把握产品质量。
6、发酵终点的判断
不同类型的发酵所要达到的目标不同，因而对发酵终点的判断标准也有所不同，产率、发酵系数、目标物浓度等均是确定发酵终点的考虑要素。目标物的形成有的是伴随菌体生长而产生的，如初级代谢产物氨基酸等，有的在生长阶段不产生，直到生长末期才分泌产生目标物，如次级代谢产物抗生素等，但无论如何，到了末期，菌体的分泌能力都要下降，使目标物的生产能力下降或停止，有的菌体因衰老而自溶，释放出的分解酶还会破坏已形成的目标物。掌握合适的发酵终点，需要考虑目标物的产量和质量、过滤速度、氨基氮含量、菌丝形态、pH、发酵液外观和黏度等参数综合权衡。

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