注射剂无菌安全存在的问题及对策思考

审评三部  霍秀敏

[摘要]  本文从剂型选择的合理性、无菌检查方法的局限性、不同灭菌方式的无菌保证水平、无菌安全的保证要素等方面，对国内注射剂无菌安全存在的问题进行了分析，同时根据无菌制剂无菌保证的要求，提出了在现有条件下提高注射剂无菌保证水平的可行的对策，以完善产品的质量保证体系，保证药品的质量、疗效和用药安全。
[关键词]  注射剂；无菌安全；问题；对策

1962年美国实施GMP以后的10多年间，无菌药品领域发生了多起触目惊心的注射剂污染事件；仅1971年3月就在7个州8家医院发生了405起败血症事件。30多年过去了，注射剂染菌所致的药难事件降临我国，“欣弗”事件使得无菌制剂的无菌保障问题成为公众关注的焦点。保证无菌制剂达到无菌要求，确保人民用药安全，是药品生产企业和药品监管部门需要认真思考的问题。本文从剂型选择的合理性、无菌检查方法的局限性、不同灭菌方式的无菌保证水平、无菌安全的保证要素等方面，对国内注射剂无菌安全存在的问题进行了分析，同时根据无菌制剂无菌保证的要求，提出了在现有条件下提高注射剂无菌保证水平的可行的对策，目的是完善产品的质量保证体系，保证药品的质量、疗效和用药安全。
1  注射剂剂型选择的合理性
剂型的选择主要考虑药物的理化性质、稳定性和生物学特性，以及临床治疗的需要和临床用药的顺应性，此外，还要考虑制剂工业化生产的可行性和生产成本等。
注射剂包括大容量注射剂、粉针剂和小容量注射剂，开发成注射剂不但要遵循上述原则，同时还要考虑制剂的无菌保证水平。换句话说就是，应优先选择无菌保证水平高的剂型。如果某主药可以制成无菌保证水平高的剂型，而选择无菌保证水平低的剂型，则应视为剂型选择不合理。在给药途径一致的情况下，剂型的选择以尽可能安全为原则。
如果主药在水溶液中稳定性较好，同时又可以耐受湿热灭菌，则适于开发成小容量注射剂或大容量注射剂；其采用的灭菌方式的无菌保证值应在6以上（微生物残存概率<10-6）。如果主药在水溶液中稳定，但不能耐受湿热灭菌，则不宜开发成大容量注射剂，可以开发成小容量注射剂或冻干粉针剂；但应注意设备和容器等的灭菌，以及冻干机、灌装和封口的环境等，即通过无菌制造工艺确保产品达到无菌要求；无菌制造工艺的无菌保证值通常不超过3（微生物残存概率<10-3）。如果主药在水溶液中不稳定，则不宜开发成小容量注射剂、大容量注射剂和冻干粉针剂，可以开发成无菌分装的粉针剂；其无菌保证值通常不超过3。
终端灭菌工艺的无菌保证值可达6以上，而无菌制造工艺的无菌保证值通常不超过3。如果改变上市产品的剂型（粉针剂、小容量注射剂、大容量注射剂互换），不但应证明变更后的剂型在安全、有效和质量可控性方面更具优势，而且其无菌保证水平也不能降低。
2  无菌检查方法的局限性
微生物的生长受温度、pH、培养基、检品特性及实验操作条件等因素的影响，要保证无菌检查结果正确，必须对无菌检查方法进行验证，只有经过验证证明可行的方法方可用于样品的检验。
我们假设无菌检查方法是可靠的，但药典规定无菌检查是抽检，即从大样本中抽取一定数量的样品，目的是通过检查抽样的无菌情况推测产品的整体情况。从统计学角度看，样本污染微生物的比例越低，抽样样品未能包含污染产品的概率就越高。
无菌产品的污染率、无菌检查取样量和因未取到污染样品而使受污染批次“通过”无菌检查的概率之间的关系可以用如下数学公式表示：
P=(1-q)n
其中：q为无菌产品的污染率
p为无菌检查通过的概率
n为无菌检查的取样量
按照药典规定的20瓶取样量，假定该批产品的污染率为1%，通过计算，该批产品“通过”无菌检查的概率应为82%。
由上述可以看出，基于抽样检验的无菌检查存在的局限性是很明显的。
3  不同灭菌方式的无菌保证水平
中国药典2005年版和美国药典、欧洲药典一样，都将终端灭菌产品的无菌保证要求规定为微生物污染概率不超过百万分之一，而采用无菌制造工艺，即非终端灭菌的产品，其无菌保证水平则为微生物污染概率不超过千分之一，要比前者相差3个数量级。故凡是可以终端灭菌的产品，务必终端灭菌，而湿热灭菌又是终端灭菌的首选方法。不同灭菌方式的无菌保证水平不同，下面为常用的灭菌方式及无菌保证水平：
（1）过度杀灭法：适用于稳定性好，能经受苛刻灭菌条件的产品；无须控制产品灭菌前的微生物污染水平。过度杀灭法的Fo≥12，微生物残存概率＜10-6。
（2）残存概率法：以生物负荷（控制产品灭菌前的微生物污染水平）为基础的方法，用于生产过程中很少检出芽孢，产品稳定性较差，只能适度灭菌的产品；生产工艺过程应当将防止产品被耐热菌污染放在首位，而不是依赖终端灭菌消除污染。残存概率法的8＜Fo＜12，微生物残存概率＜10-6。
（3）除菌过滤法：用于不能加热的产品，过滤器的除菌效率通常用过滤对数下降值LRV表示，LRV是过滤器上游菌除以下游菌的对数值。除菌过滤的LRV可以达到7，即过滤器上游每平方厘米107菌，下游可达到1个菌的水平。除菌过滤本身的除菌效率可以达到10-7水平，但是，由于人员操作及环境因素的影响，产品最终的无菌保证一般只能达到10-3水平，远远低于除菌过滤本身的水平。对于除菌过滤法，其生产系统的要求应严格符合无菌生产的GMP要求。
中国药典2005年版指出：热敏感产品的标准灭菌时间Fo可低于8，但应在生产全过程中，对产品中污染的微生物严加监控，并采取各种措施防止耐热菌污染及降低微生物的污染水平，确保被灭菌产品达到无菌要求。
4  无菌安全的保证要素
无菌安全实际上就是避免染菌。如果在生产过程中避免灭菌不完全和灭菌过程中的二次污染，就能够保证产品的无菌安全。
微生物的来源主要有以下三种途径：（1）人源。人是无菌药品生产过程中主要的污染源。有数据表明，人员操作所致的污染率超过70%；而且该数据出自管理比较到位，生产设备自动化程度较好，操作人员素质较高的企业。（2）水源。水源性微生物绝大多数为革兰阴性菌，这类微生物不会形成芽孢，故不耐热。但是，革兰阴性菌细胞外壁的主要组成为脂多糖，其代谢产物及细胞尸体或碎片均为细菌内毒素的污染源，即使通过灭菌手段将革兰阴性菌杀灭，并不能消除细菌内毒素对无菌药品质量的不良影响。细菌内毒素的热稳定性极好，一般加热到150℃数小时也不会被破坏，必须在180℃加热4小时、250℃加热45分钟或650℃加热1分钟才能完全被破坏。（3）气源。空气中的微生物基本为革兰阳性菌，它们有可能形成芽孢而使耐热性增强，更为严重的是，一旦被尘埃包藏，这类芽孢的耐热性比单独存在的状态又上升一个数量级。
针对微生物来源，控制生产过程中微生物污染就可以从以下三个方面入手：（1）在无菌药品的生产过程中，应当尽可能减少人员操作所致污染的风险，除必要的着装、清洁和消毒措施外，还应特别注意操作人员不应裸手接触任何已清洁的容器，或已灭菌的过滤器、灌装用器具等与产品接触的部位。（2）有效控制水系统的微生物污染水平，同时控制细菌内毒素的水平；应设定企业内控的警戒水平及纠偏限度，以便及时发现不良趋势，采取相应的措施，防止微生物生长，消除产生热原物质的根源。（3）防止空气中耐热菌污染生产系统，将已清洁或已清洁/灭菌的容器、胶塞及整个的灌装机置于局部单向流的保护下。无菌药品净化空调系统的设置及洁净区环境的建立和维持，在有效控制微粒的同时，也在很大程度上消除了尘埃包藏芽孢的可能，避免了造成难以灭菌的风险。
欧美及WHO GMP无菌药品指导原则中指出：可能时，在灌装前对注射剂的药液进行过滤除菌，目的是消除药液被耐热芽胞污染导致的难以彻底灭菌的不利因素。综上，避免人员污染、除菌过滤和净化空调系统，三大要素相辅相成，是无菌保证的重要基础。
5  注射剂无菌安全存在的问题
（1）注射剂的剂型选择比较随意，没有考虑剂型的无菌保证水平。例如，对可以耐受湿热灭菌的产品选择较低无菌保证水平的粉针剂等。
（2）灭菌方法的选择比较随意，没有考虑剂型的特点、微生物的情况和主药的性质。例如，对耐热的注射液，在没有监控主辅料、容器设备和环境微生物污染水平的情况下，选择流通蒸气灭菌法。或者，对耐热的注射液，即使选择湿热灭菌的方式，但灭菌工艺的Fo较低，不能保证产品达到无菌要求。
（3）目前，对一般无菌药品生产企业来说，无菌检查方法验证是一弱项，个别企业存在这样的现象：假阴性时漏检；在结果为阳性时，违反药典规定进行复检，直到“结果符合要求”为止。
（4）产品灭菌前的微生物污染来自原辅料、内包装材料、配制与灌装工艺设备、生产操作，以及生产环境等；采用无菌制造工艺生产的注射剂产品，与产品直接接触的容器、胶塞、与配制和灌装相关的储罐、管路、缓冲罐、灌装用具不能有效灭菌，灌装前药液不能进行有效的除菌过滤，以及灌装环境层流保护不够等。
6  提高注射剂无菌安全水平的对策思考
（1）剂型的选择应以尽可能安全为原则，对同一主药，应选择无菌保证水平高的剂型。也就是说，如果可以终端灭菌，则应进行终端灭菌。如果主药的热稳定性较好、能够耐受湿热灭菌，则应选择注射液（包括大容量注射剂和小容量注射剂）；如果主药的热稳定性不是太好，但是在水溶液中稳定，则可以选择小容量注射剂或冻干粉针剂，不能选择大容量注射剂；因为大容量注射剂即使采用无菌制造工艺，不仅成本高（容器设备灭菌、灌装时间长、环境区域要求高等），而且染菌的风险远远大于小容量注射剂和冻干粉针剂。如果主药在水溶液中不稳定，则只能采用无菌分装工艺制成粉针剂。
对剂型选择不合理的产品，生产企业应在无菌保证和理化指标平衡的基础上做出选择：停止生产不合理剂型；或者变更灭菌工艺为无菌制造工艺；或者变更为合理的剂型。
（2）大容量注射剂应采用过度杀灭法或残存概率法终端灭菌，小容量注射剂可以采用残存概率法或无菌制造工艺，并在无菌制造工艺后适度灭菌（辅以流通蒸气灭菌法等），提高产品的无菌保证水平。冻干和无菌分装的粉针剂均采用无菌制造工艺，在生产过程中应注意严格执行相关的GMP要求。
在确定灭菌工艺之前，首先要对工艺进行深入的研究，以提高产品的耐热性。例如，通过严格控制药液中氧的含量，从注射用水充氮保护开始，在产品密封前工艺的各个环节进行充氮保护，许多产品如复方氨基酸注射液、葡萄糖注射液、脂肪乳注射液、脂溶性维生素注射液等，都可以在121℃灭菌，甚至可以采用过度杀灭法。
生产企业应对其采用的灭菌工艺进行验证，对灭菌工艺不能达到无菌要求的产品，应对工艺进行深入的研究，通过充氮保护，提高产品的耐热性。在难以创造充氮保护条件，提高产品耐热性的情况下，应严格控制原辅料微生物和灭菌前各生产环节产生的微生物污染，提高注射剂的安全性。
（3）重视无菌检查方法的验证和无菌检验的结果，规范实验操作，科学分析实验结果，对无菌检查不合格的产品，应作报废处理，并认真查找染菌的原因，不得通过再次抽检合格放行，也不得回收染菌药液重新返工生产。仅凭无菌检查合格，不能得出该批产品无菌的结论，但无菌检查不合格，则可以得出该批产品染菌的结论。
（4）采用无菌制造工艺，与产品直接接触的容器、胶塞、与配制和灌装相关的储罐、管路、缓冲罐、灌装用具等均应灭菌；灌装前药液进行有效的除菌过滤；注意保持净化空调系统的连续正常运行，不得采用白天生产时开机，晚上停产时关机的做法，以防止气源性芽孢的污染；建立适当的动态环境标准，每批产品的生产过程中，均需对配制及灌装区的环境进行监控，超出标准限度的微生物应进行镜检，检查是否存在芽孢；建立产品灭菌前药液微生物污染水平的内控标准，监测每批产品灭菌前药液的微生物污染水平及污染菌的耐热性；例如，可将该批灌装开始、中间及结束时的产品各取一瓶，采用过滤法检查药液的微生物污染水平，将从药液中分离得到的污染菌置于80℃水浴下10～15分钟后作无菌检查，确定是否有耐热微生物，如果存在耐热微生物，产品应作报废处理；考虑定期进行培养基灌装验证，证明经过完整的生产过程，产品污染率不超过0.1%。
以上仅为个人对无菌安全存在问题的分析和提高注射剂无菌保证水平的对策思考，与业内人士和药品生产企业共同探讨，不妥之处，请批评指正。