关于Vero细胞疫苗残留物质的考虑

审评五部生物制品室高恩明

多年来，国外已成功的研制了采用Vero细胞生产疫苗并获准上市，包括人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活（纯化）疫苗（IPV），并在中国注册或正在注册申请中。在上世纪九十年代后，国产的采用Vero细胞生产的人用狂犬病纯化疫苗、乙型脑炎纯化疫苗、肾综合征出血热纯化疫苗被批准上市。近年来，又有一些企业申请乙型脑炎纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活（纯化）疫苗、甲型肝炎灭活疫苗进行临床研究或上市。随着采用Vero细胞生产疫苗种类的增多，并且使用人群扩大到婴幼儿，其细胞残留物质越来越受到关注，已成为我们审评中重点考虑的问题之一。
Vero细胞的正式名称为“非洲绿猴肾细胞”，是传代细胞的一种。所谓传代细胞可简单的理解为，在体外可以连续传代的细胞系，理论上具有无限传代的寿命。传代细胞系可以通过以下方法衍生而来，（1）正常细胞群的连续传代，繁衍成一个新的具有无限寿命的细胞群，例如非洲绿猴肾细胞的传代细胞系Vero细胞；（2）人或动物肿瘤细胞的原代细胞的系列培养，例如Hela细胞、Namalva细胞等；（3）携带致癌基因的病毒，将致癌基因转化给正常细胞，成为肿瘤细胞，例如EB病毒转化的B淋巴细胞；（4）骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，例如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
由于肿瘤细胞或携带肿瘤基因的细胞具有致肿瘤的危险，所以该类细胞不能作为细胞基质用于疫苗生产；因此用于疫苗生产的细胞系均采用非肿瘤细胞系，即正常细胞群的连续传代后繁衍的细胞系，在一定传代限度内使用，目前使用的Vero细胞属于此类。Vero细胞由于具有传代细胞特性，因此也存在理论上的潜在致肿瘤性。目前WHO认为130～150代细胞无致肿瘤性，可以用于疫苗的生产。目前国内研制的Vero细胞基质的疫苗，细胞致肿瘤试验均为阴性，已批准上市多年的产品，未见有安全性方面的问题。有报导超过170代的Vero细胞致肿瘤试验阳性。
由于传代细胞调控生长的基因失调，使得传代细胞系具有无限的寿命。因此，理论上认为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致肿瘤活性的潜在能力，因此需对疫苗的Vero细胞残余DNA进行质量控制。传代细胞可分泌生长因子（称促生长蛋白），该生长因子可以促进细胞生长，在异常情况下有致肿瘤作用，并需要持续作用。鉴于目前国际上尚无特异性Vero细胞蛋白的检测手段，现仍以疫苗蛋白总量进行间接质控。
综上所述，Vero细胞生产疫苗具有理论上的潜在致肿瘤性风险，控制该风险的措施有两个方面，其一为控制Vero细胞的代次在130～150代，其二为降低Vero细胞残余DNA含量、残余蛋白含量（通过总蛋白含量进行间接质控）。目前国际上及国外公司对Vero细胞残余DNA含量、总蛋白含量的控制标准如下表：
表1：国际上及国外公司对Vero细胞残余DNA、总蛋白含量的控制标准

表1内容显示，关于Vero细胞DNA残余量，国际上控制标准有所不同：
（1）WHO的标准比较宽松，无论是否用于婴幼儿的，均控制在≤10ng/剂量；
（2）欧盟相对于WHO，提高了婴幼儿使用疫苗的要求，婴幼儿疫苗≤100pg/剂量，非婴幼儿疫苗≤10ng/剂量；
（3）已知的两国外公司对婴幼儿疫苗更提高了要求，控制在≤10pg/剂量。
一家订入规程，一家作为内控标准。
（4）我国上市的狂犬病疫苗≤100pg/剂量，相当于欧盟的婴幼儿使用疫苗的要求。
（5）我国上市的乙型脑炎纯化疫苗（04年上市）使用人群包括婴幼儿，控制在≤10ng/剂量,符合WHO通则、欧盟通则、WHO对婴幼儿疫苗的要求，达不到欧盟对婴幼儿疫苗的要求（≤100pg/剂量），更达不到外企的控制标准（≤10pg/剂量）。
（6）肾综合征出血热纯化疫苗（02年上市）使用人群为成人，控制在≤10ng/剂量, 符合WHO通则、欧盟通则要求。
关于总蛋白含量，因疫苗（病毒蛋白）的免疫原性不同，每种疫苗不尽相同，国际上对IPV要求为≤10ug/剂量；我国要求狂犬病疫苗≤120ug/剂量；据调研，乙型脑炎的剂量≤10ug蛋白具有较好的免疫原性。在此需指出，无论是WHO、欧盟还是中国药典的要求，均为最低要求，企业需在满足上述相关要求的基础上提高要求并拟定注册标准。
对于我国企业采用Vero细胞生产疫苗，需按照注册申请的拟定注册标准（参见2004年3月12日刊登在CDE网站的《关于对预防用生物制品注册标准的理解和拟定原则的考虑》），其中包括Vero细胞DNA残余量及总蛋白残余量，建议在拟定注册标准时作如下考虑：
1.加强去除细胞DNA和去除杂蛋白（细胞蛋白）的工艺研究，最大限度的降低DNA残余量和总蛋白含量。尤其是用于婴幼儿的疫苗（如IPV、乙型脑炎疫苗等），最好能控制在 DNA残余量≤10pg/剂量，总蛋白含量≤10ug/剂量。
2.对于达不到DNA残余量≤10pg/剂量，总蛋白含量≤10ug/剂量的产品，不建议在2岁以下婴幼儿人群中使用。

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